Выявление и количественный учет нематод, паразитирующих на растениях
10.07.2014
В большинстве случаев повреждения растений нематодами не имеют четко выраженных симптомов. Исключение составляют виды родов Heterodera и Globodera, вследствие повреждения которыми на полях образуются очаги угнетенных или погибших растений, хорошо заметные при наблюдениях с воздуха (с вертолета или самолета).
Самки гетеродерид можно обнаружить визуально при осмотре корней вегетирующих растений. Без использования увеличительной оптики также можно увидеть нематод родов Longidorus и Xiphinema, просматривая разломы комочков почвы или свежевыкопанные корни растений. Мигрирующие фитонематоды в основном представлены мелкими, прозрачными формами, поэтому не могут быть обнаружены невооруженным глазом в ризосфере и корнях растений, в связи с чем необходимо использование специальных методов выделения паразитов.
Выявление и учет численности нематод в зависимости от особенностей жизненного цикла отдельных видов проводят различными методами. Нематоды, вызывающие у пораженных растений характерные симптомы, выявляют методом маршрутного обследования посевов.
При полевом обследовании визуально устанавливают зараженность растений. Для этого в 10 местах поля на пробных отрезках рядка длиной 1 м тщательно осматривают как надземные части, так и корни растений и по характерным патологическим изменениям различных органов устанавливают наличие зараженных растений, а также определяют частоту их встречаемости в процентах. Для более точного диагностирования заражений нематодами обследуемой культуры в поле отбирают пробы растений и почвы, которые затем анализируют в лабораторных условиях.
Почвенные пробы отбирают с помощью лопаты, почвенного бура или пробоотборника обычно до глубины пахотного слоя, но для учета лонгидорусов и ксифем отбор проб следует производить до глубины 0,45—0,75 м, так как наибольшей плотности их популяции достигают на этой глубине. Пробы берут в 50 местах поля объемом 5—8 см3 и объединяют в одну пробу общим объемом 250—400 см3.
Для определения заселенности нематодами растительного материала исследованию подвергают стебли (Ditylenchus), листья и почки (Aphelenchoides), корневую систему (Pratylenchus, Heterodera, Globodera). Пробы отбирают из 50 растений в разных местах поля с таким расчетом, чтобы общая масса пробы составляла 250—300 г.
Смешивать почвенные пробы необходимо очень осторожно вследствие большой чувствительности нематод к механическим повреждениям.
Пробы следует анализировать по возможности быстрее, так как потеря влаги увеличивает смертность нематод, что затрудняет их выделение. Допускается хранение растительных образцов в течение нескольких дней, а почвенных — до нескольких недель в холодильнике при —5—10°С предохранением их от высыхания.
Обычно для выделения нематод из растительных и почвенных образцов используют динамические методы, основанные на способности к активному выходу живых особей из зараженного субстрата в воду и оседанию их на дне сосуда-сборника.
Эти методы дают возможность учитывать как живые активно двигающиеся стадии нематод, так и формы, потерявшие подвижность, а также яйца.
Для первичного обнаружения нематод в растительной ткани следует погрузить раздробленные образцы корней, стеблей, листьев в небольшое количество воды в чашке Петри. Вышедших из тканей нематод можно обнаружить в воде при просмотре под стереомикроскопом.
Выделять активные стадии нематод можно также в чашках Остенбринка. Это плоскодонные невысокие чашки, заполненные водой, на которые подвешивают капроновую или металлическую сетку с молочным (ватным) фильтром. На фильтр помещают тонким равномерным слоем измельченный (0,5 см) растительный материал или почву так, чтобы они были покрыты тонким слоем воды. Нематоды, покидающие субстрат, собираются на дне чашки. Экспозиция выделения — от 5 до 50 дней. Раз в течение одних-трех суток воду из чашки с содержащимися в ней нематодами сливают в стакан, а чашку заливают новой порцией воды. Осадок с нематодами со дна стакана переносят на счетное стекло. Этот метод применяется для количественных учетов видов Aphelerichoides, Ditylenchus, Pratylenchus, а также активных стадий Meloidogyne, Heterodera и Globodera.
Метод Бермана состоит в том, что металлическую сетку (ситечко) с размещенной на ней пробой почвы или растительного материала помещают не в чашки, а в воронки диаметром 8—10 см. Почвенные пробы, во избежание загрязнения водной суспензии, предварительно помещают на молочные фильтры, а к тонкому концу воронок при помощи резиновой трубки присоединяют пробирки. Удобно пользоваться короткими пробирками, в частности отрезанными на половину длины химическими пробирками. Сетки погружают в воронки так, чтобы образцы почвы и корней растений были покрыты тонким слоем воды. Выходящие из почвы нематоды оседают на дно пробирки. В течение одних-трех суток пробирки снимают, предварительно зажав резиновую трубку. Содержимое пробирок фиксируют 4%-ным формалином, вкладывают бумажные этикетки и плотно закрывают пробкой. Зафиксированные таким образом нематоды могут сохраняться годами.
Вороночный метод используют для исследования растительного материала и почвы на зараженность нематодами родов Aphelenchoides, Ditylenchus, Pratylenchus, а также подвижными стадиями рода Meilodogyne.
При исследовании почвенных образцов вороночным методом их подвергают предварительной декантации, применяя сита с различным диаметром ячей. Почвенные образцы массой 200—400 г интенсивно размешивают в стакане в 8—10-кратном количестве воды. Через 10—20 с после оседания крупных частиц почвы воду сливают на сита, последовательно расположенные в порядке уменьшения размера ячей (соответственно 1 мм, 200 мкм, 90 мкм и 30 мкм). Эту процедуру повторяют три-четыре раза, после чего осадок с первого сита (1 мм) выбрасывают, а с остальных смывают на сетку с молочным фильтром и помещают в воронку с водой. Выделение активных нематод длится 1—3 суток.
Для получения более полной взвеси нематод, включающей потерявших активность особей, осадок с сит смывают в сосуд, после отстаивания (15—30 мин) верхнюю воду сливают, а нижнюю суспензию с нематодами переносят на счетное стекло. Этот метод наиболее приемлем для выделения удлиненных нематод родов Longidorus и Xiphinema.
Для получения концентрированной суспензии мелких видов нематод декантационно-ситовой метод можно дополнить центрофугированием. В этом случае используют сита с размером ячеек 50 и 35 мк. После смыва осадков с сит в центрофужный стакан их центрифугируют 4 мин при 1800 об/мин. Верхний слой жидкости сливают и одновременно удаляют крупные органические частицы со стен стакана, затем добавляют насыщенный раствор сахара (d =1,18), суспендируют при помощи вибромешалки и снова центрифугируют в течение 2 мин. Полученную взвесь сливают на сито с отверстием 28 мкм, а затем смывают водой в чашку Петри для подсчета. Метод позволяет выделять из почвы активных и неактивных нематод, а также их яйца.
Присутствие нематод в растительной ткани, в частности видов Meloidogyпе, Globodera, Heterodera и Pratylenchus можно обнаружить с помощью специальных красителей. Все эти методы основаны на более интенсивном поглощении нематодами красителя по сравнению с растительной тканью.
Для окраски нематод в тканях неодревесневших корней используют лактофенол — хлопковую синьку (100 г фенола, 83 мл молочной кислоты, 100 мл дистиллированной воды, 160 мл глицерина), лактофенол — кислый фуксин или раствор Флемминга (15 частей 1%-ной хромовой кислоты, 4 части 2%-ной осмиевой кислоты). Промытые и подсушенные корни опускают на 1—3 мин в кипящий раствор (0,05—0,1 %) лактофенол-хлопковой сини; затем промывают в воде и для просветления помещают в неокрашенный раствор фенола. При использовании хлопковой сини нематоды приобретают интенсивный синий цвет, а кислый фуксин дает красное их окрашивание, в то время как ткани корней остаются слабо окрашенными.
Для обнаружения нематод в одревесневших корнях их окрашивают бромфенолом синим. Сначала корни помещают на 4 ч в 0,5-— 1%-ный раствор NaCl, затем ополаскивают водой и погружают на 5—10 мин в 50%-ный спирт. Затем их подсушивают фильтровальной бумагой и окрашивают в течение 4 ч в растворе бромфенола синего или бромтимола синего (1%-ный раствор в 50%-ном спирте).
Обнаружение цистообразующих нематод в почве. Чтобы определить наличие цист, каждую пробу необходимо тщательно перемешать, просеять через сито с отверстиями 1 мм и высушить до воздушносухого состояния. Высушивание проб необходимо, так как большинство методов основано на отделении от частиц почвы потоком воды способных к всплытию цист. Влажные цисты большей частью сразу же опускаются на дно и могут быть не выловлены.
Для выявления цист пользуются методом бумажных полос, который состоит в следующем. К внутренним стенкам химического стакана объемом 1—1,5 л прикладывают лист фильтровальной бумаги, изгибая его по форме стакана так, чтобы он достигал дна, где будет оседать почва. Рекомендуется, чтобы стыкующиеся концы фильтровальной бумаги заходили один за другой на несколько сантиметров. Стакан на 3/4 заполняют водой и в него осторожно (лучше через воронку) высыпают маленькие порции (100 см3) просеянной воздушносухой почвы. В течение 2—3 мин при помощи стеклянной палочки взвесь тщательно перемешивают, после чего содержимое стакана отстаивают до оседания взвеси (не менее 10 мин). Когда верхний слой воды станет прозрачным, фильтровальную бумагу осторожно извлекают из стакана и расправляют на куске стекла или пластика. Цисты вместе с другими всплывшими включениями будут расположены узкой полоской на бумаге по уровню воды в стакане.
Для улавливания цист вместо полосок фильтровальной бумаги можно изготовить круглые фильтры. Чтобы облегчить последующий подсчет цист фильтр расчерчивают простым карандашом на четыре сектора, помещают в воронки, установленные в сосуды для сбора фильтрата, и смывают водой. Навеску из 50—100 г воздушносухой почвы взмучивают, как описывалось выше, в стакане. наполненном водой на 3/4. После отстаивания взвеси верхний слой воды со всплывшими цистами и составными частицами почвы процеживают через фильтр в воронке. Взмучивание можно проводить несколько раз. После процеживания фильтр вынимают из воронок, подсушивают, просматривают под лупой. Подсчитывают цист по секторам.
Для выделения цист имеется также специальное оборудование, которое весьма удобно при анализе большого количества проб.
Прибор Фенвика дает возможность промывать большое количество проб. Воздушносухую почву помещают на сито в воронку и смывают сильной струей воды в цилиндр прибора, где тяжелые частицы почвы оседают на дно и затем удаляются, а легкие органические части и цисты всплывают на поверхность и через слив попадают на сита (1 мм и 300 мкм). Цисты с сит смывают в чашки Петри для подсчета.
Прибор Вильке используется для промывки сырой почвы. Образец почвы (200—400 мм) засыпают в 1—2-литровую колбу и в течение 2 мин суспендируют сильной струей воды. Цисты и легкие органические частицы поднимаются с током воды и через слив попадают на систему сит, цисты собираются на сите с отверстиями 300 мкм.
Метод Мюллера представляет собой комбинацию декантационно-си-тового и центрифужного методов. Образец почвы (100—150 г) промывают на сите с размером ячей 100 мкм. Остаток с сита, содержащий крупные частицы почвы и цисты смешивают с 6 г каолина (с помощью вибромешалки), помещают в центрифужный стакан и центрифугируют в течение 5 мин при 1800 об/мин. Цисты с почвой, оседая на дне стакана, сверху покрываются слоем каолина, что препятствует их смыву при удалении надосадочной жидкости. К осадку в центрифужном стакане добавляют раствор сахара (d = 1,1), подвергают действию вибромешалки и центрифугируют 3 мин. Затем раствор сахара вместе с содержащимися в нем цистами сливают на сито с отверстиями 50 мкм, промывают водой и переносят в пластмассовый стакан с цистодробителем. Яйца и личинки подсчитывают в 1 мл водного раствора.
Метод тест-растений основан на способности узкоспециализированных видов гетеродерид образовывать цисты на растениях-хозяевах. На поле отбирают средний образец из 2—3 кг почвы, тщательно перемешивают и вносят в него фунгицид для защиты от болезней всходов (1,5 г ольпизана или тиурама 85). Этой почвой заполняют 15 небольших сосудов или стаканчиков (100 см3). В стаканчики высаживают 10-дневные всходы сахарной свеклы, выращенные на стерильной почве.
Для роста и развития растений создают благоприятные условия водного и светового режима (не менее 10 000 лк при 14-часовом световом периоде). Оценку производят через 7—8 недель путем подсчета белых цист на корнях с наружной стороны вынутого из сосуда кома земли. При наличии на нем до 30 белых цист заселенность почвы личинками можно считать слабой (до 1000 личинок на 100 см3 почвы). При количестве цист больше 30, регистрируемом менее чем в 50 % повторностей, уровень зараженности определяется как 2500 личинок в 100 см3 почвы. Если вышеуказанное количество цист обнаруживается более чем в 50 % повторностях, уровень инвазии определяется как превышающий 2500 личинок на 100 см3 почвы.
Фиксация и хранение препаратов нематод. Длительное хранение нематод обеспечивают специальные фиксирующие растворы. Наиболее широко применяется ТАФ (2 мл триэтаноламина, 7 мл 40%-ного формалина, 91 мл дистиллированной воды).
Кроме того, используют стандартный фиксирующий раствор (100 мл 50%-ного этилового спирта, 10 мл 40%-ного формалина, 10 мл ледяной уксусной кислоты). Он может быть видоизменен в следующих пропорциях: 10 мл 96%-ного этилового спирта, 3 мл 40%-ного формалина, 0,5 мл ледяной уксусной кислоты, 20 мл дистиллированной воды.
Определение нематод можно проводить на временных препаратах в капле фиксирующей жидкости, помещенной в средине предметного стекла. Каплю накрывают покровным стеклом, предварительно окружив волокном стекловаты.
Временную герметизацию обеспечивает нанесение на края покровного стекла тонкого слоя жира, глицерина или даже лака для ногтей. Лучшее качество и более длительное хранение препаратов обеспечивается при помещении нематод на предметное стекло в каплю раствора глицерина (16 частей воды + 1 часть глицерина), окрашенного полихромной синькой.
Если препарат слегка подогреть на спиртовой горелке или выдержать 1—2 суток в термостате при температуре 50°, нематоды равномерно окрашиваются синькой, их внутреннее строение лучше просматривается под микроскопом.
Чтобы избежать съеживания нематод, их сначала переносят из фиксатора в глицериновую смесь (2 мл глицерина, 8 мл 95%-ного спирта, 90 мл дистиллированной воды). Препараты покрывают покровным стеклом после испарения воды и спирта и герметизируют лаком для ногтей. Для длительного хранения нематоды помещают в смесь глицерин-желатина (30 мл желатина по 6 мл глицерина и дистиллированной воды, по 2 мл молочной кислоты и фенола).
