Главная
Новости
Строительство
Ремонт
Дизайн и интерьер




04.03.2021


04.03.2021


04.03.2021


04.03.2021


01.03.2021





Яндекс.Метрика

Криоэлектронная томография

26.01.2021

Электронная крио-томография (ЭКТ, также крио-электронная томография, крио-ET или CET) — способ получения трехмерного изображения с высоким разрешением (~4 нм). Используется для получения изображений биологических макромолекул и клеток.

ЭКТ используется с применением просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ), в которой образцы наклоняются под разными углами к электронному лучу, в результате получаются серии двумерных изображений. Серии двумерных изображений с наклоном обрабатываются на компьютере, в результате получается трёхмерная томограмма.

В отличие от методик, использующих электронную томографию, в данной методике исследуемые образцы замораживают по специальной технологии, так чтобы объект исследования не повредился кристаллами льда, давлением, химическими веществами и прочими факторами. Такая процедура называется криофиксацией. Обычно органический образец охлаждают так, чтобы образовавшийся лёд был аморфным (некристаллическим, т.о. проводят витрификацию), а просвечивание ведётся в криогенных условиях при температурах ниже − 150 {displaystyle -150} °С, что препятствует разрушению биологических структур.

Описание техники

В электронной микроскопии (ЭМ) образцы находятся в глубоком вакууме. Такой вакуум неприменим для биологических образцов, так как в клетках закипает вода и они взрываются. При комнатной температуре в ЭМ образцы обезвоживают. Другим подходом к стабилизации биологических образцов, является их заморозка (крио-электронная микроскопия). В крио-электронной микроскопии, образцы (обычно мелкие клетки (например, бактерии или Археи) или вирусы) подготавливают для исследования в обычных водных средах. Образцы погружают в криоген (обычно жидкий этан), при этом молекулы воды не успевают перестроиться в кристаллическую решетку. В результате такого охлаждения вода переходит в состояние аморфного льда. При этом сохраняются клеточные структуры, такие как липидные мембраны, которые обычно разрушаются при обычном замораживании. Замороженные образцы хранятся при температуре жидкого азота и вода не прогревается настолько, чтобы кристаллизоваться.

Образцы просматриваются в трансмиссионном электронном микроскопе (ТЭМ). Они наклоняются под разными углами относительно электронного пучка (обычно каждые 1 или 2 градуса примерно от -60° до +60°), получаются изображения под каждым углом. Серия изображений обрабатывается на компьютере и получается трехмерное изображение интересующего объекта. Полученное изображение называется томограммой или томографической реконструкцией.

Особенности

В просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) электроны взаимодействуют с материалом образца, поэтому разрешение ограничено его толщиной. Пробы должны иметь толщину не менее ~500 нм для достижения “макромолекулярного” разрешение (~4 нм). По этой причине большинство ЭСТ исследований были сосредоточены на изучении очищенных макромолекулярных комплексов, вирусов и мелких клеток, таких как многие виды бактерий и Архей.

Сильное взаимодействие электронов с веществом приводит к эффектам анизотропии. При наклоне образца электронный луч взаимодействует с относительно большой площадью поперечного сечения. Это приводит к тому, что на практике, углы наклона большие, чем 60—70° не дают много информации и поэтому не используется.

В ЭКТ также применяются крио-флуоресцентная микроскопия, световая микроскопия (например, крио-Палм) и др. методики. В этих методиках образец, содержащий флуоресцентно-меченый белок замораживается и просматривается в световом микроскопе. При этом образец должен храниться при температурах (ниже -150°С). Флуоресцентный сигнал идентифицируется и образец передается для изучения в крио-ET.