Основы изотопно-индикаторного метода

14.09.2012

Суть метода меченых атомов состоит в том, что в исследуемый объект вводят соединения, содержащие определенный элемент (или несколько элементов) с измененным изотопным составом по сравнению с природным, полагая, что различные изотопы одного и того же элемента, имея одинаковые химические свойства, будут одинаково вести себя в химических и биохимических процессах. Таким образом, данные о поведении «меченого» вещества можно перенести на поведение данного элемента в целом. Для мечения можно использовать как радиоактивные, так я стабильные изотопы элемента, важно лишь иметь удобный способ их детектирования.
При мечении не нужно заменять все атомы природного изотопного состава на какой-то один из изотопов; количество атомов изотопной метки должно лишь быть достаточным для их количественной оценки. Таким образом, изотопное меченые элемента заключается в изменении его изотопного состава, что достигается или добавлением искусственного изотопа, или изменением обычного соотношения между естественными изотопами. Например, в исследованиях азотного обмена применяют стабильный изотоп 15N, природное содержание которого составляет 0,365% с очень ограниченными флуктуациями относительно этой величины (остальное приходится на 14N). Мечение осуществляют введением обогащенного по 15N препарата, но иногда с той же целью выгоднее использовать препарат, обедненный по 15N (такой препарат значительно дешевле, так как является побочным продуктом обогащения).
Изотопный индикатор и исследуемое вещество называют соответственно меткой и носителем, которые не всегда являются изотопами одного и того же элемента. Свое назначение метка может выполнять и за счет механического или иного способа удержания на объекте изучения, особенно если этим объектом является живой организм. Пометить насекомых можно, например, радиоактивной меткой любого удобного для работы изотопа адсорбированием радиоактивного вещества на кутикуле насекомого. В общем случае выделяют три основных типа метки - изотопный, изоморфный и инертный (см. табл. 9.1). Изотопная метка идеальна, так как принадлежит тому же элементу или входит в состав исследуемого вещества как его конституционная составляющая.

Изоморфную метку используют при отсутствии удобного для работы изотопа; ее подбирают среди изотопов элементов-аналогов. Пример: применение радиоактивного изотопа 86Rb для выяснения некоторых особенностей физиологии калия. Полученные с помощью изоморфной метки результаты имеют некоторую степень условности или приближения. Примерами инертной метки для исследований перемещения почвенной влаги являются различные растворимые в воде изотопно-меченые вещества, чаще всего в анионной форме (36Сl , 131I), так как они менее подвержены сорбции в почве.
Способы введения метки в объект исследования разнообразны, но они должны обеспечивать равномерность мечения и отсутствие неконтролируемых потерь, как в начальный момент, так и в последующем. Применяют следующие способы введения метки.
1. Химический синтез с включением метки в нужном положении молекулы изучаемого вещества.
2. Биосинтез, или метаболическое включение (с использованием меченых предшественников).
3. Изотопный обмен (часто используют для мечения неорганических веществ, исходя из любой доступной формы данною элемента, например для мечения неорганического фосфора почвы с помощью любой фосфатной соли, помеченной 32Р).
4. Механическое включение (обычное инертной меткой).
Представителей почвенной мезофауны можно пометить, например, изотопным веществом, нанеся его на поверхность (механический способ) или включив его в состав обычной для данного объекта пищи (метаболический способ). Так же и процессы трансформации органического вещества в почве удобнее всего изучать с мечеными растительными остатками, предварительно полученными (выращенными) на изотопно-меченой среде.
Одним из важнейших преимуществ метода меченых атомов является то, что для надежного детектирования метки требуется ничтожное по массе количество вещества, благодаря чему введение радиоактивной метки в исследуемую систему практически не изменяет ее состояние. Чтобы убедиться в этом, рассчитаем абсолютную массу радиоактивного вещества, достаточную для проведения эксперимента, например для 1 мкКи, по известной формуле:

где А - активность, λ - постоянная распада, М - массовое число изотопа, или грамм-атом элемента, SА - число Авогадро (6,02•10в23).
Согласно расчету при активности 137Сs и 90Sr, равной 1 мкКи (или 3,7•10в4 Бк), масса радиоактивных атомов составляет соответственно 7,3 и 11,5 нг. В пересчете на концентрацию раствора с удельной активностью 1 мкКи/мл получаем значения - 10в-8 г/мл, а в почве при плотности загрязнения 1 Ки/км2 - 10в-11 г/кг.
Еще одно ценное свойство изотопно-индикаторного метода состоит в том, что во многих случаях совершенно не требуется выделять нужное вещество из объекта исследования, достаточно выполнить лишь частичное выделение, что особенно ценно, когда полное выделение вещества затруднено или невозможно, например при анализе сложных смесей в присутствии веществ-аналогов или мешающих примесей, а также при очень низких уровнях содержания вещества. Удобнее всего это показать при рассмотрении «метода изотопного разведения».
Метод изотопного разведения, предложенный Г. Хевеши в 1934г., позволяет определить содержание какого-либо вещества в системе путем включения в нее определенного количества этого же вещества с меткой (*). Примем за m количество вещества, подлежащего определению, а за m* - количество вещества, введенного с меткой (с общей активностью метки Ао, и удельной активностью ао = Ао/m*). После того как метка равномерно распределится между всей массой изучаемого вещества (m + m*), его удельная активность уменьшится до значения а - Ао/(m + m*). Объединив два выражения для общей активности в исходной метке (Ао = ао • m*) и после разведения (Ао = а [m + m*]), можно вывести уравнение для расчета массы определяемого вещества:

Необходимо лишь подставить в формулу значения исходной и конечной удельных активностей. В типичном случае, когда количество введенного радиоактивного вещества крайне мало в сравнении с общей массой немеченого вещества в системе, расчет еще проще:

Метод изотопного разведения широко используют в практике агрохимических лабораторий, например для определения с помощью почвенных вытяжек содержания подвижных форм элемента (с использованием явления изотопного обмена); в радиовегетационном методе определения запаса питательных веществ в почве; при определении коэффициентов использования питательных элементов из удобрений ив других подобных методиках.
Принцип изотопного разведения реализовав и в специальном методе определения абсолютной численности живых организмов, например насекомых, который называют методом Линкольна, или методом мечения, выпуска и повторного отлова (более лаконично англ. Capture-Recapture Method). Для популяций насекомых, клещей, червей и других беспозвоночных практически нет возможности сбора и подсчета всех имеющихся особей, поэтому для оценки плотности популяции используются различные способы относительного учета в стандартизированных условиях. В методе Линкольна ограниченное число отобранных из популяции особей метят в лабораторных условиях и выпускают затем обратно в биотоп.
По истечении некоторого времени, необходимого для естественного равномерного распределения меченых особей среди немеченых (обозначим их число соответственно N* и N) производят повторный отлов некоторого количества особей и проверяют их на наличие метки. Если нет мешающих обстоятельств (потери за счет естественной смертности, миграция за пределы биотопа и т. п.), то по соотношению между мечеными (n*) и немечеными (n) особями в пробном вылове, которое должно соответствовать установившемуся равновесию, можно рассчитать общую (абсолютную) численность популяции:

Развитием изотопно-индикаторного метода является один из новых аналитических методов, названный радиоиммуноанализом (РИА). Он входит в группу «методов конкурентного связывания», основанных на образовании высокоспецифичных комплексов типа антиген-антитело, субстрат-рецептор и т. п.

Метод заключается в добавлении к биопробе небольшого количества определяемого вещества А*, содержащего флуоресцентную, иммуноферментную или, как в нашем случае, радиоактивную метку, а также биоспецифический реагент В (например, антитела в составе антисыворотки, специфичные к исследуемому веществу). По завершении инкубирования измеряют радиоактивность продукта, для чего связанное в виде комплекса вещество отделяют от несвязанного любым подходящим способом. Неизвестную концентрацию анализируемого вещества определяют по калибровочному графику, полученному со стандартами. Из-за конкуренции между мечеными и немечеными лигандами калибровочный график получается нелинейного. S-образного вида; его желательно перевести в удобную для расчетов линейную форму посредством преобразования в специальных координатах (обычно используют координаты вида «логит-лог»). Метод РИА находит все более широкое применение при анализе сложных для выделения биологически активных веществ - пептидных гормонов, стимуляторов роста, нуклеотидов, биоспецифичных лекарственных препаратов для ветеринарии, пестицидов новых поколений и др. Типичная чувствительность определения этим методом 0,2-2 пг, т. е. 10в-12 - 10в-13 г.
Главные принципы, которым должна удовлетворять любая метка, - это индикаторность и отсутствие постороннего влиянии на характер изучаемых процессов. Применение изотопной метки, особенно радиоактивной, имеет почти абсолютную индикаторность как по специфичности, так и по чувствительности выявления. Однако применению изотопно-индикаторного метода свойственны определенные ограничения.