Культивирование фитопатогенных грибов на твердых средах

26.06.2014

При приготовлении питательных сред для грибов в качестве укрепляющего материала используют преимущественно агар-агар из красных водорослей. Дозы агара определяются его качеством, уровнем pH субстрата и способом стерилизации. Как правило, на литр воды берут 20 г агара. Чем кислее питательная среда, тем хуже застывает она при охлаждении, поэтому при необходимости дозу агара увеличивают до 30 г/л. Это же относится к питательным средам, которые повторно разжижаются, например при многократно проводимой стерилизации паром.
Вместо агара можно использовать и желатин из расчета 100—150 г/л воды, однако он имеет недостаток — при повышающихся температурах, особенно летом, легко разжижается. Твердыми питательными субстратами служат также стерилизованные корни, кусочки стеблей или зерна, причем последние особенно пригодны для массового разведения многих фитопатогенных грибов (Fusariam spp., Pseiidocercosporella herpotrichoides, Claviceps purpurea) и получения инфекционного материала. Использовать можно зерно всех видов зерновых культур. Хорошо зарекомендовала себя смесь с добавлением зерна овса из-за его пленчатости.

Приготовление питательных сред

Сначала агар плавят в колбах Коха соответствующего размера с широкой горловиной. Поскольку качество водопроводной воды очень различно, целесообразно использовать дистиллированную воду. Предварительной нарезкой или измельчением агара процесс плавления можно ускорить. Расплавленный агар фильтруют через марлю, чтобы очистить от примесей, и затем вводят описанные в отдельных рецептурах добавки, при необходимости предварительно растворенные в воде и хорошо перемешанные.
Кислотность питательного субстрата измеряют с помощью индикаторной бумаги и, добавляя 1—5%-ный раствор углекислого натрия или разбавленную фосфорную кислоту, доводят pH до 6,5—7,0. Грибы предпочитают слабокислую среду, причем следует учитывать, что при стерилизации pH еще несколько снижается.
Соответственно дальнейшему назначению питательный субстрат переливают в колбы Эрленмейера соответствующего размера (от 50 до 500 мл) или в пробирки. Сосуды должны иметь плотно скрученные пробки из хлопчатобумажной или целлюлозной ваты (самодельные или имеющиеся в продаже). Затем проводят стерилизацию в автоклаве под давлением обычно в течение 20 мин при 120 °C (около 0,1 МПа) или соответственно конкретной рецептуре. Вместо автоклава можно использовать скороварку (стерилизация текучим паром), но в этом случае обработку проводят по часу в течение трех дней. Оба способа стерилизации имеют как преимущества, так и недостатки. Однократное использование автоклава требует меньших затрат труда, но ведет к неконтролируемому изменению органических компонентов среды. Недостаток стерилизации в текучем паре, кроме большей затраты труда, заключается также в снижении pH субстрата из-за многократного нагревания. В результате питательные среды после охлаждения иногда не застывают.
Если питательные среды готовят с добавлением агара, нужно предварительно продезинфицировать чашки Петри в термостате (3 ч при 180 °C) и после охлаждения заполнить их еще горячим, субстратом. Однако, чтобы чашки не запотели при конденсации паров воды, охлаждение должно быть неполным.