Латекс-тест

26.06.2014

При латекс-тесте в серологической реакции, кроме вируса и антител, участвуют частицы латекса, на которых адсорбированы антитела (сенсибилизация). Поэтому даже при сравнительно низких концентрациях вирусов можно получить видимые реакции. В сравнении с тестом преципитации латекс-тест более чувствителен, причем, как правило, возрастает и достоверность диагностики.
Антитела из применяемых сывороток осаждают путем диализа против 25%-ного раствора сульфата аммония, осадок отделяют центрифугированием в течение 30 мин при 200 g и растворяют в 0,85%-ном растворе NaCl (1/10 или 1/20 исходного объема). Затем готовят ряд последовательных разведений раствора антител в 0,2 M трис-HCl буфере с pH 7,2 в зависимости от титра (1:500, 1:1000, 1:2000, 1:4000 и 1:6000), сенсибилизируют но Берксу Дифко-бакто-латексом 0,81 или основной суспензией латекса для RF-теста и уточняют оптимальную степень разведения для дальнейших опытов.
Вышеуказанные препараты латекса смешивают в соотношении 1:14 с 0,9%-ным раствором NaCl. Затем смесь одной части осажденного и разбавленного глобулина и одной части разбавленной суспензии латекса центрифугируют 30 мин при 5000 g. Осадок промывают 0,2 M трис-HCl буфером с pH 7,2, добавив 2% поливинилпирролидона (1%-ный раствор) в дистиллированной воде, так чтобы объем буфера соответствовал исходному объему разбавленной сыворотки. После повторного центрифугирования в течение 30 мин при 5000 g проводят еще две промывки и последний раз центрифугируют (30 мин при 5000 g). Осадок суспендируют в 0,2 M трис-HCl буфере с добавлением 2% ПВП, причем в отличие от методики Беркса количество буфера соответствует половине объема разбавленной сыворотки.
Сыворотки, сенсибилизированные описанным способом, можно хранить в холодильнике при 4°С в течение нескольких лет.

Практическое проведение латекс-теста в отличие от методики сенсибилизации очень просто. По капле сенсибилизированной сыворотки и центрифугированного сока исследуемого растения наносят пипеткой на предметное стекло со шлифованным мениском и зачерненной обратной стороной. Затем стекла со смешанными каплями встряхивают с малой амплитудой в течение 20 мин на качалке. Несколько предметных стекол рекомендуется наклеить на стеклянную пластинку соответствующего размера (рис. 14). Положительную реакцию — хлопья — видно невооруженным глазом, а также под лупой или бинокуляром, в то время как капли с соком здоровых растений остаются равномерно мутными, молочно-белыми. He следует пренебрегать постановкой контрольных тестов, в частности со смесью сока исследуемого растения и антисыворотки к вирусу, который заведомо отсутствует в испытываемом растении.
Из-за простоты методики и сравнительно низких затрат труда латекс-тест вполне пригоден для серийной диагностики. Например, разработаны методы определения вирусов некротической и хлоротической кольцевой пятнистости вишни, хлоротической пятнистости яблони, некротической желтухи свеклы, европейской мозаики кукурузы и кустистой карликовости томата в черешне.
Латекс-тест успешно применяют также для диагностики вирусов, поражающих картофель.
Примечание. Сенсибилизация сывороток обычно проводится в специально оборудованных вирусологических лабораториях, готовые к употреблению сыворотки поставляются потребителям. Однако потребность в оборудовании при этом невелика, такую работу можно организовать в менее специализированных лабораториях.
Для сенсибилизации пригодны и другие инертные частицы — эритроциты барана, бентонит, сульфат бария, хотя соответствующие методики для практической серодиагностики пока не разработаны.