Улучшение штаммов и сохранение вирулентности бактерий

21.06.2014

Bacillus thuringiensis (BT) и родственные виды

а. Патогенность и восприимчивость. В соответствии со штаммом бактерии и видом насекомого-хозяина патогенность и вирулентность ВТ могут зависеть только от токсичности кристалла, или от сочетания этой токсичности с патогенностью споры, или, возможно, главным образом от последней. Так, разница в вирулентности разновидностей alesti (anduze) и berliner для Р. brassicae определяется строением кристаллов и их перевариванием в хилусе. Таким образом, вирулентность ВТ имеет сложную природу и в дальнейшем обсуждении не будут затрагиваться различные причины вирулентности.
Вирулентность штаммов ВТ сравнивали с разной степенью точности во многих разнообразных хозяевах.
Добавление к суспензии ВТ 1%-ной борной кислоты обеспечивало явно большую смертность личинок, чем введение одной суспензии. Муцин способствует заражению саранчовых бактерией Pseudomonas aeruginosa. Эти вещества, вероятно, изменяют восприимчивость насекомого-хозяина, а не вирулентность патогена.
Танада требовал, чтобы в биоиспытаниях патогенов использовались гомогенные линии хозяев. В таблице 70 показаны результаты Айзавы, измерявшего вирулентность двух штаммов ВТ на шести линиях шелковичного червя. Вирулентность штамма В значительно колебалась для разных линий шелковичного червя по сравнению со штаммом А. Значения ЛД50 бактериального штамма А вряд ли достоверно различаются одно от другого. Значения ЛД50 бактериального штамма Б для линий В. mori Шунгетсу и J 124 явно ниже, чем для линий Дайцо, С 115 и Окуза.

б. Изменение вирулентности. 1) Разновидности. Штейнхаус и Джеррел иногда находили в спорангии ВТ два кристалла и одну спору. То же самое наблюдали Криг, Сурани и Норрис (личное сообщение). Как указывали Туманов, Ванкова, Фитц-Джемс и Янг и Сомервилл и др., спорулирующие некристаллоносные мутантные штаммы, утратившие вирулентность, довольно часто получают, например, при повторном культивировании на щелочных средах (pH 9), при обработке формальдегидом и повторных пересевах через каждые 48 ч. По данным Соммервилла и др. встречаются также, хотя и крайне редко, неспорулирующие кристаллические штаммы с абортивной споруляцией. Евлахова и Швецова отбирали вирулентные штаммы, основываясь на типах кристалла, патогенности и серологических характеристиках.
II) Изменение вирулентности путем пересевов. Неблагоприятные физические условия и присутствие ингибиторов в среде при лабораторной культуре ВТ могут подавлять рост бактерий или образование спор или кристаллов и таким образом снизить вирулентность данной партии бактерий. Однако такое снижение вирулентности, видимо, можно восстановить путем пересева бактерии на оптимальную среду без ингибирующего фактора. Смирнов сообщал о нормальной споруляции и образовании кристаллов ВТ (cereus) var. dendrolimus в среде, содержавшей 1 M мочевины в отличие от других видов и разновидностей. Это показывает, что мочевина подавляет образование кристаллов у большинства разновидностей. Смирнов изучал влияние температуры на рост кристаллообразующих бактерий in vitro и решил, что этот фактор может объяснить разницу в проявлении вирулентности для насекомых при разной температуре. Он считал желательным отбирать бактериальные штаммы более активные при низких температурах.
В листьях растений содержатся бактерицидные вещества, подавляющие образование кристаллов. Коннер и Ханзен исследовали влияние валина, лейцина и изолейцина на образование экзотоксина ВТ и родственными бактериями. Валин усиливал рост var. thuringiensis и стимулировал образование экзотоксина.
III) Изменение вирулентности путем пассирования через насекомых. Туманов проводил В. cereus через G. mellonella и P. brassicae и получил кристаллообразующий штамм. Такого же результата добился Лe Королле в результате последовательного проведения В. cereus через G. mellonella. По мнению Крига, эти результаты сомнительны, так как кристаллоносные бактерии были выделены из гусениц G. mellonella, которые не были обработаны кристаллоносными формами. Швецова и Зурабова проводили Bacillus subtilis через различных насекомых, но без появления кристаллообразователей. При проведении ВТ через бабочек Mamestra brassicae и Hadena sordida было обнаружено снижение вирулентности. Стефане восемь раз пассировала споры В. cereus через зимующих гусениц яблонной плодожорки, причем вирулентность усиливалась в 50 раз. В. cereus, выделенный из насекомых, отличался более высокой вирулентностью для плодожорки, чем штаммы, выделенные из яблок.
в. Улучшение штаммов и сохранение вирулентности. I. Провeрка. Козеица и Льюис выделили из гусениц непарного шелкопряда четыре штамма ВТ «дикого» типа, относящихся к серотипу I, и обнаружили достоверную разницу в вызываемой ими смертности и быстроте действия, Так, ЛK50 двух изолятов, 34 и 1 А составляла соответственно 2,65*10в5 и 1,75*10в7 живых спор в 1 мл, а ЛК50 в кристаллах на 1 мл соответственно 2,0*10в6 и 5,0х10в7.
Кушнер и Лиссон отобрали штаммы В. cereus, способные развиваться при pH 10,3 вместо нормального 7,5. Эти штаммы вырабатывали лецитиназу и не теряли устойчивость к щелочному pH после нескольких пересевов на нейтральную среду. Чизлетт и Кушнер отмечали, что споры этих штаммов прорастали при более высоком pH, чем споры штаммов, чувствительных к щелочной среде. К сожалению, их патогенность не была установлена. Исакова и Строева выделили вирулентные штаммы ВТ (cereus) var. galleriae не только из G. mellonella, но также из бабочек Cydia (Carpocapsa) pomonella, Agrotis segetum и H. sordida и из пилильщика Neodiprion sertifer. Из них были отобраны штаммы, использованные для промышленного производства энтобактерина-3 в 1964—1965 гг. Препараты после лиофилизации сохраняли первоначальную вирулентность при хранении в течение года.
II. Искусственно вызванное изменение, улучшение и сохранение вирулентности. Смирнов и Кантен наблюдали появление деформированных клеток у кристаллоносных бактерий после их облучения гамма-лучами Co60 в дозе 456—560 рад. После четырех последовательных пересевов число деформированных клеток не превышало 20% и период лизиса стал нормальным. Комбинируя воздействие фага и этиленимина, Наседкина и Цоткина получили сильно вирулентные и фагоустойчивые штаммы ВТ (cereus) var. galleriae.
Гукасян и Маханов получили более вирулентный штамм В. tuviensis воздействием Х-лучей (5 000—400 000 рад) или гамма-лучей Co60 (5 000—200 000 рад). После роста в культуре в течение ночи бактерий облучали и пересевали на мясо-пептонный или на картофельный агар. Штаммы с повышенной вирулентностью были получены путем обработки гамма-лучами Co60 и культивирования на картофельном агаре. Так, слабовирулентные штаммы (вызывавшие 16—28%-ную смертность) превращали этим путем в штаммы, обеспечивавшие 76%-ную (20 000 рад) и 64%-ную (5 000 рад) смертность. Аналогичные результаты были получены воздействием ультрафиолетовых лучей. Штаммы Bacillus insectus с повышенной вирулентностью убивали гусениц Dendrolimus sibiricus.
Норрис усилил вирулентность одного из штаммов ВТ для Р. brassicae путем отбора мутантов, появившихся после облучения ультрафиолетовыми лучами. Вирулентность оказалась выше исходной в семь раз. Интересно отметить, что у этого штамма даже до облучения и отбора имелась тенденция к образованию более одного кристалла на клетку, но после обработки образование многих кристаллов стало правилом. Хотя Норрис и упоминает о том, что в ходе опытов менялись также и культуральные среды, однако нельзя объяснить усиление вирулентности только изменением питательных сред.
В странах с развитым шелководством надеялись отобрать и развести такой штамм ВТ, который был бы слабо токсичен для шелковичного червя, но в то же время обладал высокой токсичностью для вредных насекомых. Айзава и Айзава и Фуджийоши получили несколько вариантов ВТ, как пользуясь ультрафиолетовым излучением, так, возможно, и в результате конверсии бактериофагов. ЛД50 (число спор на 1 гусеницу) этих штаммов для шелковичного червя составляла 10в6—10в7, для репной белянки, P. rapae crucivora 10в4 и для американской белой бабочки, H. cunea, 10в4—10в5. Капустная моль, Plutella maculipennis, также весьма восприимчива к этим кристаллообразующим бактериям. Для С. suppressalis на искусственных кормовых средах ЛД50 была ниже 10в5, но шелкопряд Dendrolimus spectabilis и бабочка Oraesia emarginata оказались относительно устойчивыми.

Bacillus popilliae и Bacillus lentimorbus

а. Изменение вирулентности путем пассажей через насекомых. Штамм Melolontha В. popilliae наиболее вирулентен для личинок майского жука, Melolontha melolontha. Три штамма проводились на протяжении трех или четырех поколений через насекомое-хозяина без изменения их вирулентности. Что касается других пластинчатоусых жуков, то новозеландский штамм В. popilliae, заражающий Odontria zealandica, был слабо патогенным для Amphimallon majalis. Споры, размноженные в Popillia japonica, были примерно одинаково патогенны для обоих видов, но в результате последовательных пассажей через Amphimallon они стали более эффективными против этого вида, но утратили эффективность против Popillia. Датки отмечал, что штаммы, выделенные из Popillia, часто оказывались гораздо более вирулентными для другого насекомого, чем его специфический штамм, и пассажи через нового хозяина обычно повышают вирулентность.
б. Изменение вирулентности на искусственных средах и отбор штаммов. Штейнкраус и Проввиденти получили на искусственных средах небольшое число, но стойких, спорообразующих штаммов В. popilliae. Некоторые штаммы, потерявшие способность образовывать споры на искусственных средах, после инъекции личинкам хозяина вновь начинали образовывать типичные споры, даже после 100 пересевов на искусственные среды. Придхем и др. наблюдали значительные колебания в вирулентности различных штаммов возбудителя «молочной болезни». Клетки В. lentimorbus, выращенного на культурных средах с содержанием фосфатов «низким» (0,3% K=HPO4) и «высоким» (0,6% К2НРО4), отличались по физиологическому состоянию, что было важно при заражении, хотя на него влияло также число инъецированных живых клеток. По данным Родса, самое сильное заболевание, вызываемое бактериальными клетками, росшими на среде с высоким содержанием фосфата, было вдвое сильнее, чем вызванное клетками, росшими на среде, бедной фосфатами. Один штамм, авирулентный при культуре на среде с низким содержанием фосфатов, становился слабо инфекционным на среде, богатой фосфатами.
Из «дикого типа» В. popilliae Родс и др. выделили штамм, образующий споры на ацетатном агаре. При испытании на ацетатном агаре ни исходный, ни другие штаммы В. popilliae не образовывали спор. Полученные споры напоминали споры, образующиеся в гемолимфе больных личинок японского жука, и вызывали «молочную болезнь». Родс 1 др. изучали особенности роста В. popilliae, культивируемого в колбах, и получили большое число вегетативных клеток без снижения вирулентности. По данным Родса, бактерии — возбудители «молочной болезни» изменчивы, в связи с чем изучается возможность получения с помощью отбора и мутаций штаммов, спорогенных in vitro. Однако в колониях отобранного штамма, в особых условиях аутентичные споры быстро образовывали не менее 20% клеток. В отличие от споруляции на твердых средах, к которой способны лишь очень немногие разновидности, многие из имеющихся штаммов образуют споры в жидких средах, содержащих углерод. Многие из новейших разновидностей, эффективно спорулирующих на искусственных средах, энергично растут в гемолимфе, и личинки гибнут до образования спор.
Подходящей жидкостью для суспензий клеток В. popilliae и В. lentimorbus в опытах с заражением личинок японского жука был 0,1%-ный раствор триптона (Дифко). Оба вида бактерий после лиофилизации сохраняли жизнеспособность не менее 12—20 месяцев.

Неспоровый бактериальные патогены

Танада составил обзор имеющихся штаммов и разновидностей неспоровых бактерий с различной вирулентностью.
Попытки повысить вирулентность путем проведения через насекомых, видимо, успеха не имели. Так, Бухер не смог отобрать инвазионные штаммы P. aeruginosa. Бухер и Хеймпел упоминают о роли бактериальных ферментов, но штаммы P. aeruginosa с равной способностью переваривать желатин, были неодинаково вирулентны.
Штейнхаус не смог повысить вирулентность Serratia marcescens путем повторных пассажей через G. mellonella или через жука Tenebrio molitor. Бухер подчеркивал, что для отбора инвазионных бактерий путем пассажей через хозяина, патогена следует скармливать насекомым, а не инъецировать, особенно неспорулирующие бактерии, считающиеся потенциальными патогенами.