Подсчет частиц

21.06.2014

Частицы можно считать в световом и электронном микроскопах, но для подсчета спор и кристаллов ВТ в порошках с большой примесью различных частиц и остатков этот способ непригоден.

Счетные камеры

При микроскопировании, когда не требуется иммерсионный объектив, лучше всего пользоваться счетной камерой. Отмеренный объем суспензии заключают между толстым, точно изготовленным, покровным стеклом и разделенной на квадраты платформой, погруженной в углубление предметного стекла. Удобнее всего вести подсчет при концентрации 10в8 частиц на 1 мл. Если избыток жидкости стечет в желобок вокруг платформы, камеру нужно перезарядить. Предметное стекло слегка смачивают и прижимают к нему покровное до тех шор, пока не появятся цветные кольца, но, несмотря на это, плохое сцепление покровного стекла с предметным часто приводит к захвату на 10—50% больше жидкости, чем требуется. Это главный источник ошибок, но его можно сильно уменьшить, измеряя интерферометром фактическую глубину слоя при каждом заполнении. После оседания частиц в течение 2 мин определяют их среднее число на малый квадрат; чтобы избежать повторного учета одних и тех же частиц, подсчитывают все частицы, лежащие на верхней и левой линиях каждого квадрата. По данным подсчета, вычисляют число частиц в 1 мл суспензии. Просчитывать необходимо не меньше 400 частиц, по 100 в каждой из 4 проб; 4 раза перезаряжать камеру, чтобы уменьшить ошибку, обусловленную неполным прилеганием покровного стекла. Перед каждым заполнением камеру следует просмотреть под микроскопом и удалить все частицы, оставшиеся от предыдущих подсчетов.
Фазово-контрастная микроскопия и микроскопия в темном поле позволяют подсчитывать неокрашенные частицы. Первый способ проще, но некоторые клетки могут быть незаметными. Второй метод применим только при очень высокой чистоте. Оба способа позволяют хорошо распознавать светопреломляющие тельца, например споры бактерий и вирусные тельца-включения, и отличать проросшие споры от покоящихся спор бактерий или Nosema. Ho отличить живые покоящиеся опоры от недавно погибших таким путем не удается. Неокрашенные светопреломляющие частицы часто подсчитывают в проходящем свете или их можно окрасить разведенным красителем (например, метиленовой синей) в жидкой фазе суспензии.
Подсчеты в камерах глубиной 0,1 мм в толстом предметном стекле дают более точные результаты, чем, например, камера Гельбера глубиной 0,02 мм в тонком стекле. Ho при сильных короткофокусных объективах (*60) иногда приходится пользоваться именно последней.

Подсчет частиц в агаровых пленках

Если необходимо применить иммерсионный объектив, частицы можно подсчитывать в агаровых пленках. Равные объемы суспензии и раствора агара с небольшой примесью туши смешивают при 45 °C и примерно 0,005 мл смеси наносят на обычное предметное стекло, нагретое до 45 °C. Сверху накладывают покровное стекло, и агар застывает в виде пленки толщиной 10—20 мк. Среднее число частиц в поле зрения определяют с помощью сетки, размерность делений которой предварительно определяют с помощью калиброванного стекла или более точно с помощью сетчатого окуляр-микрометра. Толщину слоя агара измеряют непосредственно при помощи микрометрического винта, фокусируя окуляр на частицы туши над предметным стеклом и сразу под покровным стеклом.

Подсчет частиц в окрашенных пленках

Когда для распознавания частиц их необходимо окрасить, в частности когда в препарате имеются частицы (больше чем одного типа, и если требуется иммерсионный объектив, можно использовать фиксированную пленку. Из калиброванной пипетки или микрошприца каплю определенного объема (например, 0,01 мм) равномерно распределяют на 1 см2 предметного стекла. Необходимо следить, чтобы в промежутках между отбором капель частицы препарата не оседали в шприце. Мазок фиксируют и окрашивают. Среднее число частиц в поле зрения определяют тем же способом, как и в агаровых пленках, причем нужно тщательно просматривать всю ширину мазка, поскольку частицы распределены в нем непроизвольно. Другими источниками ошибок могут быть неспособность некоторых микроорганизмов окрашиваться, а также потеря части организмов при фиксации и окрашивании. Этим методом можно определить также соотношение различных организмов или частиц, например спор и кристаллов ВТ. В этом последнем случае прекрасные результаты дает сочетание черно-синего нафтола и карболового фуксина.

Электронные счетчики

Счетчик Коултера стоит дорого, но с ним можно очень быстро просчитывать большое число образцов, хотя исследуемые образцы должны быть чище, чем бывают обычные промышленные микробиологические инсектициды. Этим счетчиком можно подсчитывать частицы диаметром до 1 мк и по числу частиц разных размеров определить их соотношение. Для подсчета удобны образцы объемом 0,05 мл, содержащие, например, 20 000 полиэдров, подсчитываемых за 14 сек, за которые они проходят через отверстие. Мартиньони и Иваи подробно описали методику 10 повторных подсчетов, проведенных для пар с переменной полярностью для каждого образца.

Подсчеты в электронном микроскопе

Капсулы вируса гранулеза (GV) можно подсчитать в электронном микроскопе, добавляя определенное число гранул полистирольного латекса и определив их соотношение.