Приготовление разведенной гомогенной суспензии
21.06.2014
Если препарат представляет собой сухой порошок, то взвешенный образец нужно прежде всего смочить и суспендировать. Это достигается добавлением анионного (но не катионного) детергента в качестве смачивателя. При использовании как суспендированного порошка, так и суспензии препарата частицы или организмы быстро оседают, и поэтому между всеми этапами работы важно тщательно перемешивать суспензию.
Следующая задача заключается в отделении частиц или организмов друг от друга и от твердых загрязнителей. Порошки сначала намачивают на 30 мин. Разделение можно произвести в смесителе, гомогенизаторе, действием ультразвука или встряхиванием со стеклянными бусами. Эффективность разделения в смесителе в большой мере зависит от скорости прибора и продолжительности обработки. Однако наряду с разбиванием комков такая обработка повреждает организмы или частицы, вследствие чего установлена оптимальная длительность обработки для подсчета максимального числа организмов и частиц. Так, у Хеймпела при обработке суспензий порошков ВТ в смесителе или ультразвуком число учтенных живых спор возрастало в течение первых 5,5 мин, после чего это число начинало уменьшаться. После 5,5 мин обработки число спор было в 6,7 раза больше, чем после 0,5 мин. Сравнительные подсчеты в различных лабораториях после гомогенизации в течение 1 мин дали крайне колеблющиеся результаты. Разные смесители имеют различные характеристики, а, кроме того, фактическая скорость лопастей в любой мешалке с нижним приводом сильно колеблется в зависимости от смазки подшипников. По мнению авторов, если гомогенизировать 0,5 г порошка в длинноцилиндровом гомогенизаторе из спеченного стекла («трубка Гриффита») и двигать поршень 10 раз вверх и вниз при одновременном вращении поршня со скоростью 20 полуоборотов на каждый ход вверх или вниз, то получают результаты, которые, вероятнее всего, будут воспроизводиться разными людьми в разных лабораториях. Эти гомогенизаторы составляют часть обычного лабораторного оборудования и поэтому всегда доступны. Эквивалентной обработкой на других аппаратах будет 5 мин в хорошо смазанном смесителе Уоринга или встряхивание со стеклянными бусами в течение 1—2 ч. Для препаратов в виде суспензий или содержащих более нежные структуры, чем опоры бактерий, время обработки необходимо сократить.
Пена, образующаяся при гомогенизации, захватывает споры, что можно предотвратить, применяя пеногаситель. Чтобы предупредить повторную агрегацию разделенных организмов, в раствор нужно включать нейтральный буфер. Применение смачивателя и поддержание однородности суспензий предотвращает удержание организмов поверхностью стекла. Поскольку здесь рассматриваются устойчивые стадии, способные противостоять экстремальным физическим воздействиям, ни один из этих компонентов не повредит им.
Для суспендирования и разведения широко используется и рекомендуется раствор 0,0425 г KH2PO4 в 1 л дистиллированной воды, доведенный NaOH до pH 7,2, с добавлением 0,2 мл смачивателя Тритон X-100 и 0,4 мл пеногасителя Dow Corning Antifoam А. Для подсчета живых микроорганизмов на чашках этот раствор автоклавируют 25 мин при 1,05 атм порциями по 250 мл для лучшего прогревания. Для подсчета частиц можно также добавлять 0,5% (по объему) насыщенного раствора формалина для отделения загрязнителей и парализации активных организмов.
