Разведение патогенов членистоногих в живых системах

21.06.2014

Размножение вирусов

Первое успешное заражение клеток насекомых облигатным патогеном произвел Tpaгep. За последующие 23 года было сообщено мало нового, пока Грейс не обнаружил NPV в культуре клеток яичника волнянки Hemerocampa leucostigma. Эти клетки содержали латентную инфекцию, и полиэдры образовались лишь после изменения состава культуральной среды. О заражении in vitro тканей В. mori сообщали Айзава и Baгo, Гоу и др. и Медведева. После 1959 г. было произведено 20 успешных заражений вирусом культур тканей или клеток насекомых.
Вирусный инокулум должен быть свободен от загрязнений или получен асептически из больных насекомых. Обычно первичные эксплантаты инокулируются во время пересева субкультуры или через 2—3 дня после этого. В качестве инокулума чаще всего используют зараженную гемолимфу. Если заражение производится в должные сроки, гемолимфа может содержать инфекционную нуклеиновую кислоту, голые вирусные палочки и (или) PIB. В качестве вирусного инокулума использовали также очищенную нуклеиновую кислоту, очищенные вирусные частицы, зараженные культуры клеток, эксплантаты тканей и растертых в порошок целых больных насекомых. Наиболее часто изучали заражение культур ткани яичника В. mori NPV В. mori. Данные об инфекционности различных инокулумов несколько противоречивы. Воун и Фолкнер и Милосердова добились заражения культур, используя гемолимфу больных насекомых и очищенные вирусные частицы в сочетании с растворенным белком PIB (полиэдров), но заражение не удавалось при использовании только очищенных вирусных частиц. Белок PIB может играть какую-то, тока неизвестную, роль в процессе заражения. Больная жировая ткань и кусочки зараженной ткани вызвали заражение вирусом культуры ткани яичников Lymantria dispar. Очищенные вирусные частицы редко бывали инфекционными. Однако другие исследования показали, что очищенные частицы могут заражать культуры ткани яичника В. mori. Ho восприимчивость к очищенным вирусным частицам чрезвычайно сильно колебалась, и высокие вирусные титры иногда не обеспечивали заражения, тогда как низкие были инфекционными. Такая изменчивость могла быть обусловлена обработками, применяемыми для выделения вирусных частиц из полиэдров, или низкой чувствительностью тестов.
Заражение поддерживаемых линий клеток энтомопатогенными вирусами послужит толчком к использованию линий клеток насекомых в качестве субстратов для производства вирусных инсектицидов. Поддерживаемые линии клеток были в большинстве случаев восприимчивы к NtPV. Линии клеток A. eucalypti Грейса обеапечивают рост радужного вируса Sericesthis (SIV), радужного вируса Tipula (TIV) и радужного вируса Chilo (CIV). В исследованиях SIV использовались очищенные вирусные частицы, а в исследованиях TIV и CIV — гемолимфа зараженных гусениц G. mellonella. Инокулировать линии клеток вирусами, образующими включения (NPV, CPV, GV), обычно не удавалось. Грейс заразил линию клеток A. eucalypti очищенными частицами NPV В. mori. Зараженными оказалось около 20% клеток, и NPV сформировался через 2,5 дня после инокуляции. Испытания авторов показали, что нуклеиновая кислота, выделенная из ткани зараженных насекомых, может служить инокулумом для заражения культур клеток. Инфекционная ДНК была выделена из NPV В. mori и тканей гусениц В. mori, зараженных NPV, инфекционная PIIK — из CPV В. mori и эпителия средней кишки зараженных гусениц. Химено и др. сообщали, что вирусная ДНК из NPV В. mori вызывала формирование телец-включений (полиэдров) в линии клеток, полученной из ткани амниона человека; однако сходные опыты, проведенные с вирусом Heliothis в четырех линиях клеток приматов (одной из обезьяны и трех из человека), не дали положительных результатов.
Инкубационные периоды после инокуляции клеток насекомых вирусами длились 1—14 дней. Тельца-включения NPV В. mori сформировались в тканях яичника В. mori через 1—4 дня после инокуляции. В ядре формировались только 1—4 PIB (максимум семь), т. е. самое малое число из наблюдавшихся в изученных до сих пор системах вирус — клетка. В культурах гемоцитов Р. saucia через 5 дней после заражения их NPV Р. saucia образуется 50 PIB на клетку. В культурах тканей яичника волнянки через 7 дней после заражения формировалось 10—20 PIB на клетку. В ткани яичника A. eucalypti, зараженных NPV В. mori, вновь появился предположительно латентный CPV. Подсчеты PIB на опубликованной фотографии показали, что цитоплазма зараженных клеток содержала 300—500 PIB на клетку. В культурах клеток обычно формировалось меньше полиэдров на зараженную клетку, чем в живых насекомых. В опытах авторов в культурах было заражено меньше 10% клеток. В линиях клеток млекопитающих выход составлял обычно 1—30*10в3 вирусных частиц (ДНК или РНК) на клетку. Исходя из среднего числа 30 ДНК или 300 РНК-частиц в одном PIB выход исчисляется в 33—100 PIB на клетку. Развитие инфекции NPV в исходных культурах клеток сходно с развитием ее в целом организме. Цитологические изменения in vitro соответствуют тем, которые наблюдаются в тканях живых насекомых.
Беллетт и Мерсер и Беллетт изучали с качественной и количественной стороны размножение радужного вируса Sericesthis в линии клеток A. eucalypti. Вирусный антиген появился в цитоплазме через 2—3 дня после инокуляции, когда было заражено около 90% клеток. Инфекционный материал был обнаружен в среде через 4,5 дня после инокуляции. Число инфекционных единиц достигло максимума через 7 дней после инокуляции. Выход составил 495 инфекционных единиц на клетку. Грейс сообщал об увеличении в 300 раз числа CPV в культурах ткани яичников A. eucalypti. Tpaгep добился увеличения в 10 000 раз содержания NPV В. mori в культуре ткани яичников, что сопоставимо с выходом при размножении в организме гусениц. Ho в гусеницах количество вируса увеличивалось в течение 2—3 дней, а в культуре ткани — в течение девяти дней. Вирусы, которые, по имеющимся данным, были размножены в эксплантатах, тканях или клетках насекомых, перечислены в таблице 50.

Разведение простейших и риккетсий

Nosema mesnili, патоген Pieris brassicae развивалась в культурах тканей Р. brassicae. В тканях гусениц, зараженных спорозоитами и трофозоитами N. mesnili и помещенных на культуральную среду, через 7 дней образовались споры. Морфологические споры, образовавшиеся in vitro, были сходны с развившимися in vivo. Патогенность и выход спор не определялись. Nosema bombycis, выделенная из В. mori, развивалась в исходных эксплантатах яичников В. mori, полученных Грейсом линиях клеток A. eucalypti и A. aegypti и в первичных культурах клеток крысы, мыши, кролика и куриного эмбриона. Споруляция наблюдалась во всех клетках, кроме клеток мыши, кролика и куриного эмбриона. Споры формировались в линиях клеток насекомых, первичных эксплантатах В. mori и в первичной культуре крысиного эмбриона.
Риккетсии, как и споровики, — облигатные паразиты. Rickettsiella, патоген жука Melolontha melolontha, развивается в КВ, Hep2, в курином эмбрионе и в клетках почек кролика. Элементы инфекции появляются в цитоплазме через 3 дня после инокуляции, накапливаются в вакуолях цитоплазмы, но не образуют типичных кристаллоидных телец-включений, наблюдаемых в живых насекомых. После 10 дней инкубации ткань, инъецированная личинкам М. melolontha, вызывала у них риккетсиоз. Патогенность сохранялась в течение трех серийных проведений in vitro. Rickettsiella popilliae, развившаяся в грейсовcкой линии клеток A. eucalypti, морфологически сходна с полученной in vivo.