Глубинная ферментация Bacillus thuringiensis

 21.06.2014

Игноффо представил схему процесса ферментации, используемого фирмой International Mineral and Chemical Corporation (IMC), для производства жидких препаратов спор и токсинов ВТ. Слегка измененный вариант этой схемы показан на рисунке 42. Игноффо не указывал состав сред и метод ферментации, но предполагается, что ферментация основывалась на патенте Мегны и протекала следующим образом: инокулум для промышленного ферментера готовили, проводя ВТ через две среды в колбах на качалках и ферментер для инокулята. В первой колбе использовали питательный бульон, а во второй и в ферментере для инокулята — среду, состоящую из 1 % свекловичной мелиссы, 0,85% сухого вещества кукурузного экстракта и 0,1% CaCO3. В каждой из колб на качалках культуру выдерживали по 24 ч. В ферментере для инокулята ее оставляли до начала обильного вегетативного роста, после чего использовали для инокуляции среды в промышленном ферментере. В этом ферментере состав среды мог колебаться, но содержание сухого вещества не должно было превышать 3—4%, а содержание сбраживаемых углеводов и азота, имеющееся для роста патогена в данной среде, исчерпывалось примерно одновременно после начала споруляции. Типичная среда содержала 1,86% свекловичной меляссы, 1,4% муки из семян хлопчатника (Pharrnamedia), 1,7% сухого вещества кукурузного экстракта и 0,1% СаСО3. После окончания споруляции питательную среду пропускали через мелкое сито для отделения крупных частиц, центрифугировали, разбавляли различными стабилизаторами и разливали в тару. В патенте Мегны было указано, что конечный продукт обладал инсектицидной активностью, а жидкая ферментированная среда в конце процесса содержала 2—5*10в9 жизнеспособных спор на 1 мл. Ho как велика была инсектицидная активность при такой ферментации, указано не было.

Глубинная ферментация Bacillus thuringiensis

В своем патенте Мегна описал процесс отделения, основанный на фильтровании ферментационной жидкости с помощью слоя мелкозернистого материала, например Целита-512, Он утверждал, что любая неуравновешенность содержания азота и углеводов вызовет неполную споруляцию, повреждение живых клеток, прорастание спор или автолиз, что осложнит отделение конечного продукта путем фильтрования. В описанном процессе фирмы IMC конечный продукт отделяют центрифугированием, устраняя эти проблемы.
Дрейк и Смис запатентовали процесс, также использованный в промышленном производстве ВТ в США. Они не соглашались с требованием Мегны об ограничении содержания питательных веществ в ферментационной среде до 3—4% и доводили их общее содержание до 6—10%. Кроме того, они не считали решающим полное использование углеводов и азота после начала споруляции. Типичная среда содержала 6,8% кукурузного крахмала, 0,64% сахарозы, 1,94% казеина, 4,7% кукурузного экстракта, 0,6% дрожжей и 0,6% фосфатного буфера. Поскольку некоторые компоненты были жидкими, фактическое содержание сухого вещества составляло 12,3%. Конечная жидкость перед сбором содержала 14*10в9 жизнеспособных спор в 1 мл; в других же опытах число спор превышало 15*10в9, В патенте утверждалась активность препарата против луговой совки, бабочки-медведицы и личинок комнатной мухи. К сожалению, выход продукта не был уточнен, а биоиспытания не были стандартизированы, и, таким образом, невозможно определить, какое количество активного материала было произведено.
В этом же патенте, помимо описания процесса ферментации, содержатся два важных наблюдения, а именно: 1) экзотоксин осаждали из ферментационных жидкостей добавлением CaCl2 или BaCl2 и 2) смесь телец-включений и водорастворимых токсинов после удаления из нее спор сохраняла активность против бабочки-медведицы, совок и личинок комнатной мухи. В одном интересном опыте из профильтрованной ферментационной жидкости, якобы свободной от спор и кристаллов, был выделен водорастворимый продукт, активный против совок.
Существуют и другие патенты на производство ВТ методом глубинной ферментации. Боннфуа запатентовал способ производства спор и токсинов в аэрируемой жидкой среде, содержащей 0,6—1% азота аминокислот, 1—2% сахара и следы кальция, цинка, марганца и магния. Продукт высушивали и смешивали с соответствующими наполнителями для получения порошка. Фирма Shell Internationale Research получила патент на среду, состоящую из 2,3% казеина, 1,0% мелиссы и 2,3% Скотаферм (побочный продукт спиртовой ферментации), утверждающий, что для ферментаций можно использовать любой из ряда штаммов ВТ, смешивая затем конечные продукты разных ферментаций, но с оговоркой, что по крайней мере один из компонентов смеси должен быть продуктом ферментации серотипа IX. Последнее требование серотипа IX непонятно и не подтверждается опытом автора.
Маджумбер утверждает, что вирулентность ВТ полностью зависела от образования «жизнеспособных спор и связанных с ними параспоральных ромбоидальных кристаллов», и добавляет, что споруляция зависела от присутствия в среде не менее 0,025 D-ксилозы. При этом не принималась во внимание самостоятельная активность кристалла. Маджумбер предлагал также проводить испытания путем инъекции спор в полость тела тараканов. Ho и здесь, если споры вызывали бы септицемию, жизненно важный барьер — стенка кишечника — не принималась бы во внимание и активность кристаллического токсина не была показана.
Статья и упомянутые патенты касались главным образом производства спор ВТ. Однако некоторые исследователи указывали на разницу в инсектицидной активности разных серотипов и препаратов ВТ. Использованный изолят ВТ и условия ферментации на полутвердой среде влияли на продукцию кристаллов и их выход зависел не только от роста микроорганизма. Далмедж изучал образование кристаллов в глубинных культурах различных штаммов ВТ, и эти результаты показаны в таблице 38. Продукция инсектицидной активности (обусловленной главным образом токсином) зависела как от штамма, так и от среды. Ни один штамм и ни одну среду нельзя было признать абсолютно лучшей. Большинство культур давало более высокие выходы (DDU50/л) на среде Профло, но разновидности dendrolimus и tolworthi вырабатывали больше токсина на триптоновой среде. Если оценивать культуры, выращиваемые только на триптоновой среде, то лучшие результаты дает tolworthi, но на среде Профло наилучшей является thuringiensis. Эффективность производства, измеряемая в единицах DDU50/10в9, колебалась у разных культур и в пределах одной культуры — при разных средах. Поскольку между продукцией спор и инсектицидной активностью не обнаружено корреляции, эти данные подчеркивают опасность оценки результатов ферментации по числу спор.
Глубинная ферментация Bacillus thuringiensis

Новейшим достижением в промышленном производстве кристаллического токсина были использование нового выделенного штамма ВТ var. kurstaki HD-1, о чем сообщал Далмедж, и разработка процесса отделения спор и кристаллов. Среды, которые Далмедж применял при изучении HD-1, указаны в таблице 39, Они были выбраны не как лучшие для производства токсина, а как образцы сред, поддерживающих рост изолятов ВТ. Среды Профло и из соевой муки экономичны при промышленном производстве, но триптоновая среда невыгодна. В таблице 40 приведена технологическая схема процесса отделения конечного продукта, которую можно суммировать следующим образом: всю ферментированную массу центрифугируют для отделения спор и кристаллов. Центрифугат взбалтывают до взвеси в 4—6%-ном растворе лактозы и осаждают ацетоном (четыре объема). Лактоза, осаждаемая вместе с кристаллами и спорами, предупреждает образование комков и облегчает ресуспендирование конечного продукта. Осадок отделяют фильтрованием при отсасывании на воронке Бюхнера, пользуясь бумагой Ватман № 1. Мелкозернистый материал для этого не требовался. Осадок промывают ацетоном и высушивают.
Глубинная ферментация Bacillus thuringiensis

Продукт, отделенный вышеописанным способом, получил наименование препарат HD-1. Далмедж исследовал выход кристаллического токсина по отношению к числу спор и сравнил результат с данными для двух экспериментальных промышленных препаратов и для французского стандарта Е-61. Хотя число спор во всех четырех препаратах было одинаковым, содержание токсина в HD-1 оказалось необычно высоким (табл. 41). В настоящее время лаборатории Эббота и фирма IMC производят HD-1 в промышленном масштабе.
Глубинная ферментация Bacillus thuringiensis

Результаты сравнительных биоиспытаний промышленного препарата HD-1 и двух других препаратов приведены в таблице 42. Повышенная активность этого препарата, измеренная в биоиспытаниях, подтверждена полевыми опытами.
Глубинная ферментация Bacillus thuringiensis

Таким образом, при глубинной ферментации выход кристаллов повышался. Поскольку продукция токсина зависит от штамма и изменений условий ферментации, можно ожидать, что в будущем выход продуктов будет заметно повышен. Это должно привести к производству более активных препаратов при меньшей стоимости и тем самым к расширению использования этого ценного микробиологического инсектицида.
Глубинная ферментация Bacillus thuringiensis