Ферментация Bacillus thuringiensis на полутвердых средах

21.06.2014

На рисунке 41 показан запатентованный Мехаласом процесс крупномасштабного производства токсинов ВТ на полутвердых средах с основой из отрубей. Здесь показаны обычно практикуемые два пассажа патогена в колбах на качалках, хотя в патенте Мехаласа указан только один пассаж. При типичной ферментации инокулум для полутвердых сред получают путем пропуска через колбы на качалках и затем в ферментер предварительной инокуляции. В колбах среда состояла из 15 г декстрозы, 5,0 г кукурузного экстракта, 5,0 г автолизата дрожжей и 4,0 г К2НРО4 на 1 л воды; pH среды доводили до 7,0—7,2 добавлением NaOH. Колбы инкубировали 8 ч при 30 °С. Ферментационная среда содержала 10 г декстрозы, 4,5 г кукурузного экстракта, 6 г автолизата дрожжей, 3,5 г K2HPO4, 0,43 г NaOH и 0,1 г CaCl2 на 1 л воды. Ферментер предварительной инокуляции заражали культурой из колбы на качалках из расчета 0,1% по объему и выдерживали 16 ч при 30 °С. Для инокуляции 1 кг полутвердой среды в промышленном ферментере использовали примерно 400 мл готового инокулума.
Производство спор и токсинов велось на полутвердой среде, состоявшей из 545 г пшеничных отрубей, 380 г вспученного перлита, 62 г соевой муки, 36 г декстрозы, 3,6 г извести, 0,9 г NaCl, 0,29 г СаСl2 и 160 мл воды. После частичной стерилизации струей пара в течение 60 мин смесь весила около 1 кг. Ее инокулировали 400 мл культуры из ферментера предварительной инокуляции и получали конечную смесь с содержанием влаги 60% по весу и pH 6,9. Для промышленной ферментации примерно 250 кг инокулированных отрубей помещали в баки с перфорированными днищами, через которые в течение первых 3 ч пропускали воздух, нагретый до 30—34°C и с относительной влажностью 95—100%, из расчета 0,4—0,6 объема воздуха на объем инокулированной среды в минуту, а затем из расчета на 1,0—1,2 объема. В баках инкубация продолжалась примерно 36 ч; за это время pH повышался до 7,5, а влажность снижалась примерно до 53%. В следующие 36 ч через отруби пропускали сухой воздух при 50—55°С, после чего среду собирали и протирали через сито 80 меш. Влажность конечного продукта равнялась 4%, а pH — 7,0. Продукт был эффективен против эталонного чешуекрылого (Estigmene асrеа) и эталонного двукрылого — комнатной мухи (Musca domestica).

Описанный процесс представляет типичную ферментацию на полутвердой среде. Его можно очень точно контролировать благодаря ферментеру для предварительной инокуляции, но при ферментации в производственных баках возникает много вопросов. Сами отруби при нагревании не стерилизуются, но содержание микроорганизмов обычно снижается настолько, что они не влияют на ферментацию. Воздух, поступающий в бак, чист, но не стерилен. Нижние слои отрубей эффективно отфильтровывают загрязнителей, поступающих из воздуха, и препятствуют их распространению по смеси; в результате эти слои часто сильно загрязняются. Само по себе это не было бы проблемой, если не считать снижения выхода качественного продукта. Ho, проходя через отруби, воздух образует в них каналы, что ухудшает аэрацию и регулирование температуры в отдельных частях массы отрубей. Это можно устранить только тщательным, однократным или повторным, перемешиванием отрубей во время ферментации, но тогда загрязнение может распространяться из нижнего слоя по всему баку, и это снижает качество конечного продукта. Обе проблемы можно устранить, фильтруя воздух через стерильные фильтры и заменив баки галтовочными перфорированными барабанами.
Используемый штамм ВТ и условия ферментации оказывают сильное влияние на образование кристаллов на полутвердых средах. На Симпозиуме по определению и испытанию вирусов и ВТ, используемых для борьбы с насекомыми, Далмедж описал исследование этого аспекта ферментации, проведенное фирмой Nutrilite Products Inc. В таблице 36 сравнивается активность шести штаммов ВТ var. thuringiensis, при ферментации на полутвердых средах. На среде из отрубей все штаммы образовывали примерно равные количества спор. Ho инсектицидная активность их колебалась чрезвычайно сильно — от 1 : 10 до 1 : 20 000, т. е. различалась в 2000 раз. Влияние условий ферментации на образование кристаллов видно из данных таблицы 37. Когда один и тот же штамм выращивали при шести различных режимах ферментации на одной и той же полутвердой среде, выход продукции колебался от 3*10в9 до 17*10в9 спор/г. Активность этих продуктов колебалась от 240 до 1400 МЕ/мг. Отношение числа ME к числу спор при различных режимах ферментации изменялось от 40 до 280 МЕ/10в6 спор. Таким образом, достигаемая активность зависела не только от роста культуры микроорганизма, но также и от условий ферментации.

Поскольку количество получаемых кристаллов можно изменять путем выбора соответствующего штамма и модификации процесса ферментации, вероятно, можно повысить и эффективность препаратов, получаемых на среде из отрубей. Ho, чтобы добиться существенной пользы от таких изменений, потребуется тщательное регулирование ферментации. Ввиду недостатков процесса ферментации на полутвердых средах такой контроль трудно осуществить. Поэтому в будущем глубинная ферментация, видимо, вытеснит метод ферментации на полутвердых средах при промышленном производстве.