Химия экзотоксина

20.06.2014

Экзотоксин, очищенный де Баржаком и Дедонде, Шебестой и др. и Бонди и др., содержит аденин, замещенный в положении 9. Доказательства его присутствия дают хроматография и УФ-спектроскопия, выделение пикрата и масс-спектроскопия. Аргументы, касающиеся места замещения и литература по этому вопросу приведены в статье Бонда и др.
Все очищенные материалы содержат фосфат. Указывались различные соотношения аденин : фосфат — 1 : 1,2, 1 : 0,98 и 1 : 1,04. Два последних соотношения подтверждаются данными элементарного анализа экзотоксина на свободную кислоту. Если принять, что весь азот находится в аденине, то получают соотношения 1 : 1,06 и 1 : 1,08.
По данным трех лабораторий, молекулярный вес исследованных экзотоксинов составлял от 707 до 850. Значение 707 очень близко к тому, что требуется для структуры, предлагаемой группой Шебесты. Однако анализ того же материала на азот указывает молекулярный вес, равный 795. Точный метод, при помощи которого было получено значение 707, из французской статьи неясен. Их ссылка на Methods in Enzymology, III, вероятно, относится к Бендиху. Описанный ими метод дифференциального затухания можно применить к свободному аденину в кислом растворе. Поскольку де Баржак и Дедонде не упоминают в разъяснениях о гидролизе или о последующей хроматографии, они, по-видимому, применяли данный метод непосредственно к свободной кислоте своего экзотоксина. Если это так, то метод в данном виде непригоден. По указанному ими значению содержания аденина, можно вычислить (ε262,5—ε290) их раствора. Если этот показатель использовать затем с (ε262,5—ε290). Для 10 мкг/мл раствора аденозина, то содержание аденина будет составлять 166 мкг на 1000 мкг экзотоксина, что дает молекулярный вес 810, хорошо соответствующий их результатам анализа на азот. При этом новом толковании вычисленные значения молекулярного веса укладываются в пределы 730—850, причем оба предельных значения получены в одной лаборатории.

Водородный спектр ядерного магнитного резонанса экзотоксина, выделенного в лаборатории авторов, показан на рисунке 15. Область низкого поля спектра, включающая синглеты при 8,4 δ и 8,2 δ и дублет при 6,13 δ, почти идентична эквивалентной области в спектре аденозина и сходна с соответствующей областью для АМФ. Наряду с данными о гидролитическом расщеплении остатка аденина это обстоятельство свидетельствует, что замещение аденина в положении 9 осуществляется частью, имеющей аномерный протон, чье магнитное окружение сходно с окружением в аденозине, АМФ, АДФ и АТФ. На полях выше 3,4 δ никакого сигнала не обнаружено, и поглощения около 1,8 δ и 3 δ обусловлены внутренним блокирующим (хелатным) соединением — натриевой солью 3-(триметилсилил)-пропансульфоновой кислоты. Отсюда следует, что все протоны в экзотоксине, неспособные к обмену на дейтерий, присоединены к атомам углерода, связанным с электроотрицательными заместителями. Для природного продукта это ограничивает химический класс неидентифицированных группировок углеродами или определенными аминокислотами. Поскольку ни экзотоксин, ни один из продуктов его гидролиза не реагируют с нингидрином, та часть молекулы, которую необходимо определить, должна быть по природе углеводом.
На рисунке 16 показан фосфорный (Р31) спектр ядерного магнитного резонанса магниевой соли экзотоксина. Спектр был получен с помощью компьютера средних переходов и показывает сдвиг на +0,3 части на миллион по отношению к 85%-ной H3PO4 как внешнего эталона. Магниевая соль АМФ имеет сдвиг для P31 на — 0,1 часть на миллион. Данные о сдвигах P31 для сложных эфиров фосфорной кислоты очень скудны. Te же, что имеются, показывают, что разница между указанным выше значением и значениями для эфиров двуосновной фосфорной кислоты невелика. Однако опыты по ферментативному и химическому гидролизу (см. ниже) определяют экзотоксин как эфир одноосновной фосфорной кислоты, и сдвиг P31 не противоречит этим результатам. К сожалению, эту сложность разрешить не удалось.

Экзотоксин можно дефосфорилировать кислыми или щелочными фосфомоноэстеразами. В результате получают дефосфорилированный экзотоксин, который использовался в структурных исследованиях Шебесты и др. и Бонда и др. Такой же дефосфорилированный экзотоксин образуется при гидролизе экзотоксина в ацетатном буфере при pH 4 в темпе, который определяет фосфатную часть, как эфир одноосновной фосфорной кислоты.
Из дефосфорилированного экзотоксина путем кислотного гидролиза (1 н. H2SO4 при 100°C) в течение 2 ч была получена аллослизевая кислота; ее определили путем сравнения с подлинным материалом. Продолжительный гидролиз (Доуэкс-50 [Н+], 14 ч при 100°С) дефосфорилированного экзотоксина дал 5%-ный выход D-глюкозы, которую качественно и количественно определили с помощью оксидазы глюкозы.
Водородный спектр ядерного магнитного резонанса дефосфорилированного экзотоксина на рисунке 17 сходен со спектром экзотоксина, но не идентичен с ним. Пояснения, сделанные ранее в отношении протонов аденина и аномерного протона, приложимы и здесь, и следует отметить, что эти три протона появляются при почти точно таком же химическом сдвиге в обоих соединениях. Сдвиг аномерного протона указывает на взаимозависимость между H1' и H2'. Имеется также дублет при 5,17 δ, который на основании результатов упомянутого выше гидролиза можно приписать аномерному протону глюкозы. Химический сдвиг и константа связи (около 3 циклов/сек) совместимы с конфигурацией α-D-глюкопиранозы.

Сходство между экзотоксином и аденин-нуклеотидами в отношении непосредственного молекулярного окружения аденина, на которые указывают спектры ядерного магнитного резонанса, подтверждают также спектры дисперсии оптической активности и исследования скоростей разрыва N-глюкозидной связи, катализированного кислотой. Кривые дисперсии оптической активности экзотоксина и его магниевой соли показаны на рисунке 18 вместе с кривой для АТФ. Сходство формы кривых очевидно. Из этого можно заключить, что если аномерная связь с аденином идет от пентофуранозы, то она имеет β-конфигурацию. Скорости гидролиза экзотоксина в 1 н. H2SO4 при 100 °C измерялись по началу восстановления по появлению аденина. Константа скорости реакции первого порядка имеет значение 10в-3 с-1, идентичное ее значению для АМФ.

Спектры УФ и ядерного магнитного резонанса, кривые дисперсии оптической активности и скорости гидролиза показывают, что аденин замещен в положении 9 рибофуранозным остатком в β-конфигурации.
Кислотный гидролиз дефосфорилированного экзотоксина давал в дополнение к аденину и аллослизевой кислоте нейтральный сахар, имеющий молекулярные размеры дисахарида, но устойчивый к кислоте в условиях, способных вызывать расщепление дисахарида. Химическая природа этого фрагмента точно обрисована работой Фаркаша и др. Проведенные реакции и достоверные измерения, проведенные на различных соединениях, суммированы в схемах на рисунках 19 и 20.

Молекулярные веса соединений IV и VII, полученные методом масс-спектроскопии (соединение IV на рис. 20), показывают, что дисахарид образуется в результате слияния гексозы и пентозы. Гексозу можно определить как глюкозу, образовавшуюся в результате сильного кислотного гидролиза соединения III (R = Me). Кривая дисперсии оптической активности соединения VI позволяет предположить, что пентоза представлена рибозой. Способность соединения III (R = Me) образовывать ацетонид IV подтверждает идентичность пентозы, и при этом условии она должна замещаться в положении 5'. Чехословацкие исследователи также приводят доказательство, сходное с описанным нами выше, о том, что аденин замещается рибозой.
Положение заместителя глюкозы связано, возможно, довольно сильно с химическим сдвигом 4-го протона в соединении VIII. Этот сдвиг прекрасно согласуется со сдвигом 3-го протона в соединении X, т. е. 3-О-метил-β-D-глюкопиранозатетрацетате. Поэтому жаль, что в соединении IX, более сходном с X, 4-й протон сдвинулся вверх по полю от своего значения в соединении VIII. Тогда с очень небольшой оговоркой, касающейся положения заместителя глюкозы, можно считать, что структура III представляет продукт катализированного кислотой гидролиза (R = H) или метанолиза (R = Me) дефосфорилированного экзотоксина.

Фаркаш и др. использовали затем структуру соединения III вместе с другими доказательствами, которые обсуждаются ниже, чтобы предложить соединение XI в качестве структуры экзотоксина.
Размещение групп на остатке аллослизевой кислоты Фаркаш и др. основывали на данных инфракрасного спектра, согласно которым при очень мягкой кислотной обработке экзотоксин образует γ-лактон, в то время как дефосфорилированный экзотоксин образует 2 γ-лактона. Однако исходя из характера ионного облика различных соединений мало вероятно, что создающееся равновесие является равновесием между оксикислотой и ее γ-лактоном, потому что «лактоны» обладают более сильным сродством к ионообменной колонке, чем исходные оксикислоты. Это видно не только из положения мест элюции, но и из ширины соответствующих пиков. Нет оснований полагаться на данные инфракрасного спектра и отвергать данные об ионном обмене, хотя в представленном виде они несовместимы. Обобщение этих двух результатов возможно при условии, что лактонизадия, если она и происходит, то происходит во время испарения фракций с ионообменной колонки. По этой гипотезе, пользуясь номенклатурой Шебесты и др., дефосфорилированный экзотоксин и лактон В во время их вымывания из колонки представляют собой монокарбоновые кислоты. При последующем испарении карбоксильная группа лактона В лактонизируется, тогда как карбоксильная группа дефосфорилированного экзотоксина не лактонизируется. Лактон А элюируется с колонки в форме дикарбоновой кислоты, одна из карбоксильных групп которой лактонизируется в течение последующего испарения. Отсюда следует, что в дефосфорилированном экзотоксине уже замаскирована одна карбоксильная группа.

Авторы наблюдали очень сходную картину при обработке дефосфорилированного экзотоксина кислотой в мягких условиях и последующем анализе его методом ионообменной хроматографии. Ни один из компонентов при выделении не дает инфракрасного пика при 1770 см-1— обстоятельство, легко объясняемое использованием буфера с более высоким pH (8,5), чем тот, которым пользовались Шебеста и др.
Это объяснение данных ионного обмена и инфракрасного анализа можно было бы согласовать, приняв структуру, предложенную Фаркашем и др. (XI), но для этого требуются некоторые дополнительные сведения о природе и степени маскировки карбоксильной группы в дефосфорилированном экзотоксине в момент его элюирования из колонки. Получить эти данные будет нелегко, поскольку всегда необходимо как-то удалять компоненты буфера.
Структура (XI), предложенная Фаркашем и др., не позволяет объяснить выделение рибозы де Баржаком и Дедонде.
Авторы недавно выделили аденозин как продукт гидролиза дефосфорилированного экзотоксина. Условия его образования точно определены и позволяют объяснить как первичное обнаружение рибозы де Баржаком и Дедонде как продукта гидролиза экзотоксина, так и последующую неудачу Шебесты и др. при попытке воспроизвести этот результат. Его выделение служит окончательным химическим доказательством существования аденино-рибозной связи в экзотоксине и тем самым ставит под сомнение природу рибозо-глюкозной связи в структуре (XI), предложенной Фаркашем и др.
Структура (XI), предложенная Фаркашем и др., довольно хорошо обобщает наши знания о химии экзотоксина, но пока ею нужно пользоваться осторожно. Требуется больше данных о механизме присоединения глюкозы к аллослизевой кислоте и о том, является ли дисахарид (III) истинным структурным компонентом или артефактом.
Важной особенностью экзотоксина была и есть его неспособность кристаллизоваться. Это исключает возможность применения рентгеноструктурного анализа при изучении его структуры. Она обусловливает также некоторую неуверенность в идентичности экзотоксинов, полученных в различных лабораториях. Авторы этого обзора обменялись образцами экзотоксина с группой Шебесты и с X.Г. Хуангом из International Minerals Corporation (Иллинойс). Если хроматографию, электрофорез и ионный обмен можно считать надежными критериями, то все три образца были идентичными.