Протеолиз токсичного белка В. thuringiensis

20.06.2014

Достоверно установлено, что кристалл фактически представляет собой протоксин и что истинным токсином является более мелкая молекула, образующаяся в результате протеолиза в кишечнике насекомого. Мартуре описал внешний вид кристаллов, после того как они более получаса подвергались растворению в хилусе Р. brassicae. Сначала кристаллы теряли способность двойного лучепреломления, набухали, деформировались и в конце концов исчезали. Фауст и др. довольно детально исследовали растворение кристаллов В. thuringiensis var. pacificus в выделениях средней кишки Bombyx mori. По их данным, в кишечнике насекомого происходит сначала не протеолиз, а частичное растворение кристалла в результате высокого местного pH. Вероятно, это связано с разрывом связей белок — кремний, и только после этого могут действовать кишечные протеазы. В одном из опытов, описанном в подтверждение этого, изучалась активность кишечных протеаз в боратном буфере. При pH 9 в 0,05 M бората или карбоната активность кишечных протеаз была одинаковой, если в качестве субстратов использовали азоальбумин, фибрин крови или казеин. Если те же самые условия использовали для гидролиза целых кристаллов, активным был только фермент в карбонатном буфере. В самом карбонатном буфере растворялось до 14% суспендированных кристаллов, а в боратном буфере белок совсем не растворялся. В противоположность этому Лекадэ и Мартуре нашли, что кишечные ферменты В. mori в боратном буфере способны гидролизовать кристаллы, хотя использовался борат с pH 10. Трипсин, химотрипсин, папаин и проназа не гидролизовали не затронутые денатурацией кристаллы белка при pH 8—9,5. Кишечные ферменты и Р. brassicae и В. mori были способны гидролизовать такие кристаллы. Кукси доказал, что химотрипсин, трипсин, субтилизин, равно как и ферменты Р. brassicae, могли гидролизовать растворенный и переосажденный кристаллический белок в карбонатном буфере при pH 9,5, вызывая образование токсичных фрагментов с таким же распределением по размеру, как при хроматографии на сефадексе G-200 (рис. 13). Этого следовало ожидать, поскольку Лекадэ и Дедонде показали, что две кишечные протеазы, выделенные в очищенном виде из хилуса Р. brassicae, обладали специфичностью, сходной, но несколько более широкой, чем трипсин и химотрипсин. Изучение методом дискового электрофореза процесса протеолиза интактных кристаллов и растворенного белка кишечными протеазами Р. brassicae показало, что реакции были сходными. Хотя в ходе реакции состав лизатов различался, их конечные составы были идентичны в пределах ошибки метода. Лизат можно было предварительно фракционировать путем диализа. Так, Лекадэ и Мартуре доказали, что как диализируемая, так и недиализируемая фракции были токсичны перорально и при инъекции в полость тела гусениц Р. brassicae. Лучшая фракция была получена на сефадексе G-75. Часть гидролизованного белка, отделяемая на G-75, была определена как белковая фракция с молекулярным весом (м. в.) около 50 000, а та, которая не задерживалась сефадексом, — как пептидная фракция (м. в. около 5000). Размер белковой фракции можно было уменьшить (при одновременном увеличении пептидной фракции) путем более длительного выдерживания в термостате. Белковая фракция оказалась неоднородной, поскольку в ней были обнаружены другие молекулы с м. в. около 13 000. Эта фракция дала шесть аминокислот с концевыми аминогруппами и шесть полос при электрофорезе на крахмальном геле. Отсюда Лекадэ и Дедонте сделали вывод, что в лизате было шесть белковых компонентов.

Протеолиз токсичного белка В. thuringiensis

Пептидная фракция содержала свободные аминокислоты, а также четыре пептида. Эти пептиды были очищены на DEAE-сефадексе в 1%-ной коллидинуксусной кислоте. При инъекции гусеницам Р. brassicae все четыре пептида 'были токсичны, но в меньшей степени, чем лизат, из которого они были выделены. Поскольку фракционирование проводилось при 35 °С, пептиды могли пострадать от нагревания, потому что при выдерживании неразделенной смеси пептидов при 25 °C в течение всего фракционирования ее активность заметно ослабевала. Однако неразделенные лизаты можно было хранить не меньше трех лет при -22 °С, а лизаты лиофилизированные или осажденные сульфатом аммония — при 4 °С. Кукси опубликовал результаты, параллельные данным Лекадэ, хотя фракционирование было менее полным. Разделение лизата на сефадексе G-200 показано на рисунке 13. Более высокий антигенный пик (2) представляет фрагменты с м. в. около 40 000 и совпадает с пиком токсина (4). Второй пик токсина (4), элюированный примерно около фракции № 30, не давал осадка при количественном иммуноиспытании (2). Возможно, пептиды во втором пике реагировали с антисывороткой, но продукт был слишком невелик, чтобы выпасть в осадок. Пендлтон подтвердил и значительно расширил открытие Лекадэ и Кукси. Первоначально он находил такие же профили элюции, когда разделял лизаты на сефадексе G-200. Первый пик элюции почти определенно представлял собой непереваренный кристаллический белок. Его можно удалить, добавив большее количество тех же кишечных ферментов и повторно выдерживая лизат в термостате. После 4 ч выдерживания смесь содержала только мелкие пептиды с м. в. около 5000. В противоположность Кукси, Пендлтон не обнаружил материала с м. в. 40 000. Однако Лекадэ и Дедонде нашли, что в их опытах белковая часть гидролизата была относительно устойчива к дальнейшему протеолизу. Пендлтон продолжил фракционирование полученного гидролизата, используя специфические антисыворотки, и сумел скорее замаскировать, чем разделить, три антигена, обнаруженные им в лизате. Антигены можно было маскировать каждый в отдельности или попарно. Определение токсичности каждой фракции показало, что только один из антигенных детерминантов был токсичным; однако антиген, обозначенный Пендлтоном «h» и присутствовавший в значительной части лизатов кристаллов из 93 штаммов, оказался лишь слаботоксичным, когда лишь он один не маскировался антителом; сочетание его с одним из двух других антигенов было столь же токсичным, как и необработанная пептидная фракция. Молекуле требуется не меньше двух незамаскированных антигенов, чтобы участвовать в действии на участке, где токсин активен. Пендлтон высказал предположение, что на одной молекуле было три антигенных участка, поскольку при электрофорезе на полиакриламидном геле они мигрировали совместно. Когда антисыворотка, специфичная для одного участка (гамма-глобулины с высоким молекулярным весом), реагировала с молекулой и смесь пропускалась через колонку сефадекса G-50, два других антигенных детерминанта следовали за прореагировавшим и появлялись в отделяемой на сефадексе фракции с высоким молекулярным весом. Это было еще одним доказательством, что все три антигенных участка были на одной и той же молекуле.