Хроматографические методы разделения полипептидов кристаллического белка В. thuringiensis

20.06.2014

Хроматографический метод разделения по молекулярным весам, или гельфильтрация, применялся для приготовления белковых фракций с узкими пределами молекулярного веса. Ватанабе и др. нашли, что кристаллы в растворе с pH 11,5 и хроматографированные при pH 7,8 в 0,1 M фосфатном буфере разделялись на два токсичных компонента. Однако эти компоненты были скорее второстепенными, а не главными компонентами исходного раствора. Они изучали В. thuringiensis var. sotto. Кукси получил сходные результаты для изолята Маттеса с той разницей, что токсичные компоненты были главными и различались иммунологически. Сомервилл и др., работавшие с В. thuringiensis var. alesti (изолят anduze), установили, что белок отделялся на сефадексе G-100 и G-200 (но о биологичеокой активности фракций не сообщали). DEAE-целлюлоза применялась во всех трех исследованиях для последующей очистки. Результаты Сомервилла и др. свидетельствуют о трудности работы с растворенным кристаллическим белком. Они пытались хроматографировать кристаллический белок на DEAE-целлюлозе, уравновешенной 0,01 M tris-HCl при pH 8,3. Фракция (I) белка элюировалась 0,4 M (NH4)2CO3 в 0,01 M tris-HCl, а вторая фракция (II) — 0,1 н. NaOH. После концентрирования путем лиофилизации и повторной хроматографии каждая фракция давала тот же профиль элюирования. Обе исходные фракции и фракции, полученные из них в результате повторной хроматографии, вели себя одинаково в иммунодиффузионном тесте. Такое поведение служит хорошим доказательством обратимой агрегации. Профиль элюции очень напоминал тот, который описывали Ватанабе и др., и, видимо, не представлял настоящую ионообменную хроматографию, а скорее общую десорбцию белка вслед за применением каждого растворителя. Недавно Кукси (неопубликованные данные) разделил два главных антигена кристаллического белка изолята Маттеса В. thuringiensis var. thuringiensis на DEAE-целлюлозе при pH 9 в 0,05 M глицин — NaOH, содержащем 10в3 M p-меркаптоэтанола при градиенте NaCl от 0 до 0,2 M (рис. 12). Антиген, характерный для штамма Маттеса, был совершенно свободен от второго антигена. При скармливании гусеницам Р. brassicae обе фракции оказались токсичными. Этот метод дает возможность изучать отдельные антигены кристалла, как отдельные белки.