Методы изготовления препаратов спор и кристаллов Bacillus thuringiensis

20.06.2014

Для отделения спор от кристаллов можно использовать четыре их основных свойства — относительную плотность, свойства поверхности, растворимость и прорастание споры. Каждое из этих свойств было использовано отдельно или в сочетаниях с другими для получения препаратов, содержащих меньше 0,03% примесей других частиц.
Одним из наиболее успешных оказался метод двухфазного разделения (жидкость — жидкость). Первоначальное описание его дано Ангусом, но затем было опубликовано много видоизменений (табл. 12). В основном метод заключается в следующем: массу, состоящую из спор и кристаллов, суспендируют в водном растворе соли в делительной воронке, добавляют неполярную фазу и воронку встряхивают. После разделения фаз споры преобладают в слое на поверхности раздела, а кристаллы остаются во взвешенном состоянии в водной фазе. Повторные обработки межфазного слоя дают дополнительные количества кристаллов, а взбалтывание водного слоя со свежими партиями неполярной фазы — более чистые суспензии кристаллов. Автор испытал большинство опубликованных методов на изоляте Маттеса В. thuringiensis и считает наиболее пригодным метод Муррея и Спенсера. Многие из опубликованных методов разработаны применительно к конкретным штаммам В. thuringiensis. Поэтому способ, дающий успешные результаты в отношении одного штамма, не обязательно будет лучшим и для другого.

Второй метод, оказавшийся перспективным, — это разделение спор и кристаллов сочетанием поверхностного заряда и плотности в аппарате для непрерывного электрофореза, описанном Ханнигом. Здесь используют слой (пленку) буфера, протекающий между стеклянными пластинками, и получают относительно чистые споры и кристаллы. Если не требуется сохранить целые кристаллы, то содержащийся в них белок можно выделить путем растворения и повторного осаждения, как будет описано ниже. Если для растворения белка применяется мягкий метод, то после центрифугирования и повторной промывки можно из гранул получить чистые жизнеспособные споры.