Окраска бактерий по Граму
25.06.2014
Разрабатывая методы дифференциации бактериальных клеток в тканях животного организма, Христиан Грам со своими сотрудниками предложил специальный метод окрашивания. Этим методом было положено начало распределению всех бактерий на две группы: на окрашивающиеся по Граму и неокрашивающиеся.
Впоследствии этот метод окраски видоизменялся и усовершенствовался, но в основе остался тем же. Техника окраски сводится к следующему: клетки бактерий окрашиваются основной, слегка подщелоченной краской, например кристалл-виолетом, затем протравливаются йодом в йодистом калии или пикриновой кислотой. Окрашенные препараты промываются водой и нейтральным спиртом или ацетоном. Этим промыванием удаляется краска у одних видов бактерий и сохраняется у других. Первые носят название грамотрицательных, вторые — грамположительных бактерий.
Тот факт, что разные бактерии по-разному удерживают краску, важен не только с точки зрения проблемы окраски, но сам по себе имеет более широкое значение, так как указывает на химическое различие клеток у этих представителей микроорганизмов. Грамокраска является показателем свойств и состояния биологической или наследственной особенности, иначе природы организма. Эти свойства должны быть использованы не только как диагностический, но и как систематический признак в классификации бактерий.
В практике клинических лабораторий данный признак широко и результативно используется. В классификации, однако, он не учитывается или учитывается в малой степени, что безусловно является его недооценкой.
Способность воспринимать и удерживать краску по Граму присуща многим организмам из класса бактерий, почти всем актиномицетам и микобактериям, грибам, дрожжам. Большинство клеток высших растений и животных не окрашивается по Граму. Ho отдельные включения в клетках этих организмов, в частности ядро, ядерный гиалин, ядерное вещество и др., грамположительны. По Граму окрашиваются вирусные белки, бактериофаги и актинофаги.
С окрашиваемостью по Граму связаны многие другие свойства бактерий. Так, например, грамположительные бактерии более устойчивы к растворяющему действию щелочей, протеолитическому действию энзимов — трипсина, пепсина, панкреатического сока; они более чувствительны ко многим ингибиторам — к антибиотикам, к анилину, фенолу, этиловому спирту, толуолу, бензолу, ксилолу, хлороформу, эфиру, йоду, к основным краскам и другим веществам. В клетках этих бактерий концентрируются такие аминокислоты, как аргинин, глютаминовая кислота, гистидин, лизин и тирозин. При окраске метиленовой краской, эозином они становятся более чувствительными к свету и т. д.
Свойство окрашиваться по Граму может в значительной степени меняться даже у одного и того же вида в зависимости от возраста культуры, питательной среды и других внешних условий. Например, на малоблагоприятных средах часто бактерии теряют способность окрашиваться по Граму или окрашиваются в слабой степени. Сенная палочка — Вас. subtilis становится грамотрицательной, если ее выращивать на среде с кровяной иммунной сывороткой. Некоторые авторы наблюдали окрашиваемость по Граму у кишечной палочки, выросшей на жидкой белковой среде с большим содержанием глюкозы и солей MgSO4, NaCl. Спороносная палочка — Вас. cereus после пребывания в водопроводной или дистиллированной воде слабее окрашивается по Граму, а многие клетки совсем не окрашиваются, становятся грамотрицательными. Механизм действия воды остается неизвестным. He выяснено также, имеет ли здесь место потребление грамположительной субстанции как питательного вещества при голодании или это вещество растворяется в результате автолитических процессов, которые протекают в этих условиях довольно интенсивно.
Кнейзи с сотрудниками установил, что малые дозы бензимидазола, прибавленные к среде Дюбо, превращают туберкулезную палочку — Mycob. tuberculosis типа avium из грамположительной и кислотоустойчивой в грамотрицательную и некислотоустойчивую форму. Автор полагает, что бензимидазол подавляет синтез рибонуклеиновой кислоты — существенной составной части грамположительной субстанции.
Как видно из приведенного, значение среды в окрашиваемости клеток по Граму очень велико. Недостаточно хорошо подобранная среда может ввести в заблуждение исследователя при диагностике вида бактерий. Поэтому во всех сомнительных случаях, когда нечетко выражена окраска, рекомендуется применять несколько питательных сред. На окрашиваемость клеток по Граму большое влияние оказывает также и возраст культуры. Как правило, молодые клетки сильнее окрашиваются, чем старые. Односуточная культура более грамположительна, чем двух-трехсуточная и, тем более, пяти-шестисуточная. В некоторых случаях старые культуры более грамположительны, чем молодые. У спороносных бактерий — Вас. mesentericus, Вас. subtilis и других видов грамположительное вещество обнаруживается в клетках в стадии споруляции и даже после того, как спора уже оформилась, т. е. в остаточной плазме (эпиплазме). Это вещество не обесцвечивается при десятиминутной обработке 95%-ным спиртом.
Более сильная окрашиваемость по Граму молодых клеток, по-видимому, обусловлена базофильностью протопласта, его способностью сильно поглощать краски вообще.
Окрашиваемость клеток в значительной степени зависит от их индивидуальных особенностей. Две рядом расположенные клетки одного возраста часто окрашиваются с различной интенсивностью. Степень окрашенности клеток меняется от длительности обесцвечивания, от метода фиксации и вообще от способа приготовления препарата и реактивов. Толстые мазки длительней обесцвечиваются, чем тонкие.
Окрашиваемость по Граму связана и с видовыми особенностями организма. Одни виды, например гонококки, некоторые микобактерии, легко меняют окрашиваемость при выращивании в разных условиях, другие сохраняют ее более или менее стойко. Следовательно, грамокраска обусловлена не только техникой окрашивания, но и видовыми качествами культуры, свойствами вещества клеток. Само собой разумеется, что при определении степени окрашиваемости по Граму необходимо придерживаться определенных стандартов как в способах приготовления препаратов, так и в последующих манипуляциях — фиксации, окраске, обесцвечивании и пр.
Сущность окраски по Граму, несмотря на многочисленные исследования, остается неустановленной. Высказывались и теперь высказываются различные взгляды и теории. Все они сводятся к трем основным — химической, изоэлектрической и клеточной проницаемости.
Химическая теория грамположительной окраски бактерий берет за основу особенности состава плазмы клеток. Согласно этой теории в клетках грамположительных бактерий находятся особые вещества, воспринимающие краски и не отдающие их обратно или отдающие с трудом при промывании. Одни авторы связывают грамокраску с наличием в плазме жирных кислот лецитина или липопротеидов. Эти вещества плотно соединяются с краской и йодом и не обесцвечиваются при обработке спиртом. Шумахер изолировал из клеток дрожжей жирные кислоты, после чего клетки теряли способность окрашиваться по Граму. Эти утерявшие грамокраску клетки снова приобретали ее после обработки жирными кислотами. Работами Петерсон с сотрудниками и других авторов была отвергнута роль ненасыщенных жирных кислот в грамокраске в связи с тем, что у грамотрицательных бактерий этих же кислот оказалось не меньше, чем у грамположительных.
В последнее время приписывают грамокраску особой нуклеопротеидной грамположительной субстанции, рибонуклеиновой кислоте, точнее — рибонуклеату магния. Установлено, что путем гидролиза или посредством обработки желчными солями можно лишить клетки грамположительной субстанции и превратить их в грамотрицательные. Бартоломеу и Умбрайт, удаляя рибонуклеат магния кристаллической рибонуклеазой, делали клетки грамотрицательными. Искусственно удаленный рибонуклеат магния может быть снова наложен на те же клетки.
Эта как будто убедительная теория оказалась несостоятельной. Было выявлено, что грамположительная субстанция, выделенная из клеток, не накладывается на грамотрицательные натуральные бактерии. У последних также обнаруживается не меньше рибонуклеиновой кислоты и рибону-клеатов магния. Изолированные из бактерий кишечной группы, эти вещества в свою очередь не накладываются на грамположительные клетки (предварительно освобожденные от грамположительной субстанции), например на клетки клостридиума — Clostridium velchii.
Генри, Стаей и др. приходят к заключению, что грамокраска зависит от соотношения нуклеопротеидов с рибонуклеиновой и дезоксирибонуклеиновой кислотами. У стрептококков и у клостридиума — Cl. velchii это соотношение равно 8 : 1, а у грамотрицательных бактерий — 1:3. Другие авторы не подтвердили закономерности этих соотношений.
Митчель и Мойле придают наибольшее значение особому, неизвестной природы, веществу «ХР», которое содержит фосфор, соединенный с рибонуклеатом грамположительной субстанции. По их данным, вещество «ХР» всегда обнаруживается в клетках грамположительных бактерий. Однако последующие исследования показали, что это вещество находится в большом количестве и у грамотрицательных бактерий, а у некоторых из них — Bact. coli, Bact. aerogenes, Neisseria catarrhalis — его содержится даже больше, чем у грамположительного бацилла — Вас. subtilis, а также у пивных дрожжей. Шугар и Барановская пришли к заключению, что решающая роль в грамокраске принадлежит не рибонуклеиновой кислоте, а белку клеток.
Теория изоэлектрической точки, выдвинутая Стирн и Стирн, состоит в том, что у грамположительных бактерий изоэлектрическое состояние плазмы отличается от состояния плазмы у грамотрицательных. Авторы определяют это состояние плазмы способностью окрашиваться или воспринимать кислые и основные краски при разном значении pH. Если устанавливать pH протопласта клетки в таком состоянии, когда в равной степени в нем удерживаются основные и кислые краски, то можно заметить, что у грамположительных бактерий это состояние будет при pH = 2, а у грамотрицательных при pH = 5. Промежуточное положение занимают бактерии, у которых грамокраска выражается неопределенно, то выявляясь, то не выявляясь.
Следует отметить, что установление изоэлектрической точки, в сущности, производится в зафиксированной йодом клетке и, если она определяет исход окрашивания по Граму, то только мертвых клеток. Применяемый метод фиксирования йодом вызывает окисление плазмы. Окислителями могут быть и такие вещества, как бром, пикриновая кислота, двухромовокислый калий, тринитробензол и др. Эти вещества окисляют какие-то компоненты протопласта, придают ему более кислый характер и сдвигают изоэлектрическую зону. Сдвиг происходит у всех бактерий, как это показали Стирн и Стирн, но у грамположительных бактерий он более сильно выражен, чем у грамотрицательных, благодаря чему различие в степени кислотности у данных групп микробов значительно усиливается от йода и других протравителей. Этот факт, если он справедлив, показывает лишь то, что биохимическое состояние плазмы грамположительных бактерий отличается от состояния плазмы у грамотрицательных бактерий. Иными словами, живое вещество тех и других организмов различно.
Данная теория грамокраски бактерий тоже не имеет достаточных подтверждений в ряде экспериментов. Во-первых, некоторые исследователи не подтвердили, что йод как окислитель можно заменить другими реактивами при протравливании клеток. Во-вторых, если теория, справедлива, то йод должен и до окраски вызвать тот же эффект, но этого не происходит. Далее, если теория правильна, то при данной окраске разрушенные клетки, или, вернее, содержимое разрушенных клеток, должно было бы окрашиваться так же хорошо, как и плазма целых клеток, чего в действительности не наблюдается: протопласт разрушенной клетки не окрашивается по Граму.
В основе теории проницаемости лежит различная способность оболочки и клеточной мембраны пропускать краски и протравители. Высказывалось предположение, что в клетке образуются нерастворимые осадки краски с йодом, не вымываемые спиртом. Известно, что йод с некоторыми красками, например с метилвиолетом, действительно образует коллоидный комплекс, не растворимый в воде. В пользу этой теории говорят некоторые другие факты, например то, что разрушенные клетки — грамотрицательны. Стоит тем или другим способом нарушить целостность оболочки (растиранием с песком, автолизом, лизисом и др.), как способность окрашиваться по Граму утрачивается. Бенианс делит бактерии по их способности окрашиваться на три группы.
Первую группу составляют бактерии, у которых оболочка пропускает краски и йод, но образовавшиеся внутри клетки молекулы йода с краской не пропускает. В результате протопласт весь остается окрашенным после промывания спиртом. Вторая группа бактерий имеет оболочки, которые не пропускают внутрь краски и поэтому легко обесцвечиваются при окраске по Граму. У третьей группы бактерий оболочка пропускает краску и йод; она же свободно пропускает и образовавшиеся комплексы внутри клетки при обесцвечивании.
Стирн и Стирн отрицают точку зрения Бенианса на том основании, что йод и краска не дают таких крупных частиц, которые не проникали бы в клетку. Кроме того, соединение йода с краской диссоциируется в спирте; следовательно, при промывании препарата получаемый комплекс должен тоже раствориться и выйти через оболочку.
Высказывалось предположение, что для самого йода проницаемость оболочек у грамположительных и грамотрицательных бактерий различна. Например, для предотвращения выхода краски из клетки грамотрицательных бактерий требуется очень большая концентрация йода, в то время как для предупреждения выхода краски из клеток грамположительных бактерий достаточно 0,01% и менее йода в метиловом спирте.
Подводя итог, можно сказать, что вопрос о сущности окраски по Граму остается до сих пор неразрешенным. Ни одна гипотеза и ни одна теория не объясняют всего разнообразия в окрашиваемости клеток у разных видов и групп бактерий.
Надо полагать, что способность окрашиваться по Граму определяется свойством всего протопласта и оболочки, вместе взятых, а не одной какой-либо частью клетки. Степень окрашиваемости, или прочности соединений плазмы с краской, зависит от внешних условий роста культуры, от ее возраста и других причин.
