Хроматографический метод определения аминокислотного состава почвы

30.08.2012

Навеску почвы в 20-30 г помещают в коническую колбу, куда добавляют 100 мл 6 н. H2SО4; колбу и ее содержимое нагревают на этернитовой плитке при слабом кипении в течение 24 час. Полученный гидролизат освобождают от избытка серной кислоты путем осаждения ее раствором Ва(ОН)2 и отделения полученного осадка BaSО4 от раствора. Избыток бария, кальций и полуторные окислы выпадают в осадок при добавлении углекислого аммония. Затем гидролизат пропускают через колонку, наполненную Н-катионитом (ионообменные синтетические смолы типа эспатита, вофатита и т. п.). В кислой среде аминокислоты полностью адсорбируются на катионите, а содержащиеся в гидролизатах прочие органические вещества и неорганические кислотные остатки (анионы) уходят в фильтрат при промывании катионита дистиллированной водой. Адсорбированные на катионите аминокислоты элюируются из катионита путем многократного встряхивания последнего с СаО (1 г СаО на 10 г катионита) и 2%-ным водным раствором аммиака. Полноту извлечения аминокислот из катионита контролируют по нингидринной реакции. Полученные таким путем элюаты аминокислот выпаривают на водяной бане почти досуха, сухой остаток растворяют в точно отмеренном объеме дистиллированной воды. Из этого раствора микропипеткой отбирают пробу в 0,01-0,04 мл (в зависимости от предполагаемого содержания аминокислот) для нанесения на хроматографическую бумагу № 3. Последнюю предварительно обрабатывают цитратно-фосфатным буфером, имеющим рН 7,8 (0,2 м. раствор лимонной кислоты + 0,1 н. раствор Na2HPО4). Для хроматографического разделения аминокислот из почвенных гидролизатов автор использовал два растворителя: 1) водонасыщенный фенол и 2) амиловый спирт+изопропиловый спирт+уксусная кислота+вода (соотношение 4:4:1:1). Применение этих растворителей позволяет изолировать следующие аминокислоты: цистин, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота, серии, гликокол, аспарагин, треонин, аланин, пролин, тирозин, триптофан, валин, фенилаланин, лейцин+изолейцин. Локализованные на хроматограмме аминокислоты проявляют хингидрином. Общие приемы хроматографического анализа достаточно полно описаны в соответствующих руководствах по хроматографии.
При описанной выше предварительной очистке аминокислот на катионите и при использовании пробуференной бумаги № 3 получают весьма точную локализацию аминокислот, чем достигается полное отделение их друг от друга. После проявления хроматограммы нингидрином окрашенные участки бумаги, на которых локализованы те или иные аминокислоты, вырезают из хроматограммы и обрабатывают верональным буфером (веронал + НСl, рН = 7,0); при этом окраска полностью переходит в буферный раствор; интенсивность ее измеряют на спектрофотометре или фотоколориметре. Предварительно по показаниям отсчетов обработанных таким же путем образцовых растворов аминокислот при различной их концентрации вычерчивают градуировочные кривые, по которым и находят концентрацию определяемой аминокислоты в исследуемом растворе. Точность определения, по данным многочисленных проверочных анализов, составляет +5% общего содержания аминокислот в исследуемом объекте.