01.09.2017
31.08.2017
08.08.2017
14.07.2017
06.07.2017
19.06.2017
19.06.2017
19.06.2017
15.06.2017
12.06.2017
Изотопно-индикаторные исследования в области физиологии
 14.09.2012

Очень велика роль изотопно-индикаторного метода в установлении механизмов фотосинтеза зеленых растений. В 1941 г. С. Рубин с помощью стабильного изотопа 18О получил доказательства того, что образующийся при фотосинтезе кислород происходит не из СО2, а из Н2О. В середине 1940-х - начале 1950-х гг. М. Кельвин, А. Бенсон и Дж. Бассам с сотрудниками провели детальное исследование механизмов фотофиксации углерода на одноклеточных зеленых водорослях с использованием меченого 14СО2. Выяснилось, что фиксация СО2 происходит через 3-фосфоглицериновую кислоту и другие С3-соединения, а позднее были выделены и все ферменты, участвующие в фотосинтетическом цикле. Работы эти стали этапными, в них был отработан широкий набор методических подходов и приемов (включая двумерную бумажную хроматографию, радиоавтографию и др.). Радиоизотопную метку стали широко использовать и другие исследователи. Меченная по тритию вода была применена для изучения темновой стадии фотосинтеза, а меченные по 14С и 15N препараты глицина помогли изучению путей биосинтеза порфиринов. Применение импульсных меток с очень короткими, секундными экспозициями 14СО2 в 1960-70-е гг. позволили открыть истинные первичные продукты фотосинтеза, относящиеся к С4-соединениям (оксалоацетат, малат, аспартат и др.).
Изучение механизмов дыхания растений осуществлялось тоже в основном с использованием радиоиндикаторных методов. Цикл трикарбоновых кислот Кребса, играющий одну из центральных ролей в обмене веществ, был постулирован еще в 1937 г., а подробно расшифрован с помощью меченных 14С метаболитов к началу 1960-х гг. Аналогичные методики применяли в исследованиях биосинтеза сахаров, аминокислот, жирных кислот и других липидных соединений, многих других классов органических веществ.
Также широко применяли введение меченых предшественников для последующего обнаружения метки в продуктах метаболизма. В исследованиях на культурах микроорганизмов удобным оказался метод изотопной конкуренции, который помогал устанавливать предшественников изучаемого метаболита введением немеченых предшественников в растущую культуру с предварительно помеченными метаболитами. Допуская, что перенос углерода происходит в одном направлении, т. е. необратимо, результат «угадывания» предшественника должен быть ниже удельной активности в изучаемом метаболите.
Начало широкого использования меток с 14С, 3Н и других приходится на середину 1950-х - 1960-е гг., когда в лабораториях появились жидкостно-сцинтилляционные спектрометры, отличающиеся высокой эффективностью счета и универсальностью в применении к различным источникам излучений. Эти и другие инструментальные методы, включая газовую и жидкостную хроматографию в сочетании с масс-спектрометрией (МС), ядерным магнитным резонансом (ЯМР), инфракрасной спектрометрией (ИКС), помогли значительно продвинуть исследования молекулярной структуры и механизмов действия многих сложных биохимических веществ, включая такие хозяйственно значимые, как антибиотики, фито- и микооксины, ауксины и другие регуляторы роста.
При изучении корневого поглощения NO3-, и NH4+ денитрифицирующей активности микроорганизмов сначала применяли короткоживущий изотоп 13N (Т1/2 = 10 мин); позднее исследования со стабильным изотопом 15N стали основными в изучении различных вопросов обмена азота в растениях, почве, ризосфере. Исследования потоков минеральных и синтезированных веществ через сосудистые системы растений, механизмов мембранной проницаемости, процессов запасания ассимилянтов и др. производили в значительной мере с применением различных радиоактивных изотопов (32Р, 35S, 3Н, 14С и др.). Для изучения транспирационного потока в древесных растениях, листовой проводимости воды применяли тритиевую метку (НТО). Реальные скорости движения потоков воды, растворенных минеральных веществ и ассимилятов впервые были определены не по косвенным, а по прямым наблюдениям с радиоактивной меткой. Клеточную проницаемость, транспорт ионов К* в корневых волосках и по сосудам флоэмы и ксилемы изучали или с помощью короткоживущего изотопа 42К ( Т1/2 = 12 ч), или - с изотопом химического аналога калия 86Rb.
Многие вопросы физиологии растений были исследованы с применением очень удобного и наглядного метода - радиоавтографии, в макро- и микровариантах метода (т. е. на целых растениях или на гистологических срезах).
Первые эксперименты с изотопной меткой на животных относятся еще к началу 1920-х гг. (Хевеши), но широкое применение данные методики получили только вначале 1950-х гт. Радиоизотопные и другие методы позволили составить подробнейшие карты основных путей метаболизма, общие для всех живых организмов. Использование изотопа 14С сыграло также решающую роль в изучении биосинтеза НАД у млекопитающих.
Методом РИА изучали вопросы гормонального статуса и регуляции, в том числе такие, которые имеют важное значение для хозяйственного животноводства. В исследованиях физиологических функций сельскохозяйственных животных, например связанных с паразитарной инвазией и другими заболеваниями, нашли применение меченные различными способами эритроциты (с 51Сr, 32Р, 59Fe, и др.). Радиоизотопы помогают количественно оценивать размеры кажущейся и истинной абсорбции макро- и микроэлементов в желудочно-кишечном тракте животных и его отделах, степень реабсорбции веществ в организме, изучать перенос веществ через мембраны (в кишечнике, на плацентарном и гемато-энцефалическом барьерах и др.), определять объемы и скорости потоков физиологических жидкостей»
На лабораторных животных изучали способность тканей (органов) к накоплению веществ различной химической природы, лекарственных и ветеринарных препаратов. Локализацию меченых соединений удобно выявлять методами радиоавтографии с использованием замораживающего микротома или in vivo с применением техники сканирования или сцинтиграфии, которые дают картину распределения введенного меченого вещества в организме. Меченые радиофармацевтические препараты в экспериментах на животных позволяют значительно ускорить процесс исследований и испытаний новых лекарственных препаратов.
Радиоизотопное мечение мелких животных из природных популяций используют для выяснения местонахождения животных и их гнездовий в трудных для наблюдений условиях. Еще чаще его применяют в энтомологических исследованиях в натурных условиях - для уточнения ареалов и скорости рассеяния, определения абсолютной численности и плотности популяций, установления эффективности мер подавления «вредных» видов насекомых и других беспозвоночных, выявления естественных хищников, поедающих таких насекомых.
Радиоизотопы применяли во множестве исследований по биохимии и физиологии насекомых и клещей, развитию их резистентности (устойчивости) к инсектицидам, особенно часто - для определения проницаемости кутикулы и установления механизмов действия пестицидов.
В заключение отметим, что радиоизотопные методы как одни из наиболее удобных и быстродействующих нашли очень широкое применение в современных молекулярно-биологических и генно-инженерных исследованиях. С их помощью создают ДНК-зонды, распознающие гены и локусы агрономически важных признаков, отвечающих за развитие растений и их устойчивость к неблагоприятным факторам и болезням. Они помогают в конструировании генов и векторных систем для переноса генного материала в соматические и генеративные клетки растений и животных. Изотопные методики применяют для установления структуры геномов, теоретических исследовании устойчивости к абиотическим и биотическим стрессам, разработки методов генетической трансформации растений с целью получения полезных свойств, разработки новых технологий иммунизации животных, создания негормональных (рекомбинантных) стимуляторов роста животных и иммунодиагностических тест-систем для ветеринарных целей.