07.11.2017
31.10.2017
21.10.2017
21.10.2017
21.10.2017
04.10.2017
04.10.2017
28.09.2017
01.09.2017
31.08.2017
Методы определения нематод
 26.06.2014

Опытные нематологи могут определить род нематоды при малом увеличении микроскопа, просматривая чашки с суспензией нематод. Для определения же вида в большинстве случаев требуется исследование под микроскопом при очень сильном увеличении с применением определенных рабочих приемов, таких как обездвиживание, умерщвление, фиксация и приготовление препаратов нематод.

Обездвиживание

Идентификацию нематод рекомендуется проводить на живых экземплярах, чьи морфологические и структурные особенности устанавливаются с большей достоверностью, чем у умерщвленных или фиксированных особей. Однако большая подвижность некоторых видов затрудняет наблюдения, поэтому нематод следует обездвиживать.
1. Нематод помещают в раствор дихлорэтилового эфира (2 капли на 50 мл воды) и вскоре они полностью теряют подвижность. При замене раствора чистой водой нематоды приобретают прежнюю активность.
2. Осторожное кратковременное нагревание до 45—50 °С вызывает у нематод тепловое оцепенение. Техника выполнения этого приема заключается в следующем. Предметное стекло, на котором находится капля с нематодами, многократно быстро проводят через пламя горелки либо кратковременно нагревают на водяной бане. Слишком сильное нагревание ведет к структурным изменениям тела нематоды.
Умерщвление

Длительное хранение нематод и, в частности, связанная с этим фиксация предусматривают их умерщвление. Обычно его проводят путем теплового воздействия, многократно проводя предметное стекло с нанесенными на него нематодами через пламя маленькой бунзеновской горелки. Суспензии относительно большого объема помещают в термостаты при 60—70 °C. Время экспозиции зависит от объема данной суспензии: после достижения температуры умерщвления (60 °С) оно должно составлять не более нескольких минут.
Для умерщвления нематод можно применять химикаты, например раствор Люголя (2 г йодида калия, 1 г йода и 100 мл дистиллированной воды), разведенный в соотношении 1:1000. К суспензии, содержащей нематод, добавляют одну или несколько капель такого разбавленного раствора.
Фиксация

Чтобы сохранить в течение длительного срока нематод, предназначенных для использования в качестве сравнительного, диагностического или коллекционного материала, их фиксируют. Фиксацию, которая следует непосредственно за умерщвлением нематод с целью подавления сразу же начинающихся процессов разложения, можно проводить с помощью различных фиксирующих растворов, которые одновременно служат и средой для хранения. Ниже приведены прописи некоторых фиксирующих растворов.
Фиксирующий раствор ФА (мл): формалин (40%-ный) — 10, ледяная уксусная кислота — 10, дистиллированная вода — 80.
Фиксирующий раствор ФAA (мл): этиловый спирт (96%-ный) — 10, формалин (40%-ный) — 3, ледяная уксусная кислота — 0,5, дистиллированная вода — 20.
Стандартный фиксирующий раствор (мл): этиловый спирт (50%-ный) — 100, формалин (40%-ный) — 10, ледяная уксусная кислота — 10.
Фиксирующий раствор ТФД (мл): триэтаноламин — 2, формалин (40%-ный) — 7, дистиллированная вода — 91.
Примечание. Перед перенесением в фиксирующий раствор нематод следует умертвить, иначе они сморщиваются и деформируются.
Приготовление временных препаратов нематод

Приготовление временного препарата может понадобиться при определении видов нематод. С помощью очень острой иглы, тщательно заточенной бамбуковой щепки или тонкой пипетки одну или несколько особей переносят в каплю фиксирующего раствора в середине предметного стекла. По краю капли располагают несколько коротких волокон стекловаты, диаметр которых примерно равен диаметру исследуемых нематод. Затем на каплю накладывают покровное стекло так, чтобы не образовалось пузырьков воздуха. Объем капли должен быть достаточным для заполнения пространства между предметным и покровным стеклами. Избыток жидкости удаляют с помощью фильтровальной бумаги пли другого гигроскопического материала. Если нематоды равномерно распределились в центре зоны, закрытой покровным стеклом (контроль под стереомикроскопом), можно приступать к временной герметизации препарата. Используя тонкую кисточку, края покровного стекла запечатывают, например лаком для ногтей. Тщательная заделка (под стереомикроскопом при небольшом увеличении) предупреждает улетучивание среды и обеспечивает возможность хранения препарата в течение нескольких дней. Если препарат нужен всего лишь на несколько часов, то для его герметизации края покровного стекла перед наложением на каплю достаточно смазать жиром или покрыть парафином (погружение в вазелин или расплавленный парафин).
Приготовление постоянных препаратов нематод

Для приготовления сравнительного и диагностического материала, а также для учебных целей необходимы постоянные препараты фитопатогенных нематод.
Фиксированных нематод помещают в очень маленькую каплю смеси глицерин-желатина (30 мл желатина, по 6 мл глицерина и дистиллированной воды, по 2 мл молочной кислоты и фенола) на предметном стекле и хранят в непроницаемом для пыли месте до затвердевания (1—2 нед). После этого на предметное стекло наносят более крупную каплю жидкого желатина и накрывают препарат покровным стеклом. Еще через 10—20 дней края покровного стекла запечатывают каким-нибудь герметиком (например, лаком для ногтей) и снабжают препарат этикеткой.
Хорошей средой для постоянных препаратов нематод является чистый глицерин. Предпосылкой сохранности служит полная пропитка нематод глицерином. Чтобы избежать съеживания и деформации паразитов, необходимо соблюдать тщательность в работе. Умерщвленных нематод сначала хранят не менее 12—24 ч в маленьких чашечках (часовые стекла, блок-чашки), заполненных фиксирующим раствором состава 10 мл 40%-ного формалина, 10 мл ледяной уксусной кислоты + 80 мл дистиллированной воды. Затем фиксирующий раствор почти полностью отсасывают с помощью пипетки и добавляют 3—4 мл глицериноспиртовой смеси (2 мл глицерина, 8 мл 95%-ного спирта, 90 мл дистиллированной воды). Чашечку с нематодами помещают во второй сосуд и хранят в термостате при 50 °С, предохраняя от проникновения пыли.
Вследствие постепенного испарения воды и спирта нематоды оказываются в конце концов в чистом глицерине, однако испарение должно происходить не слишком быстро, иначе нематоды могут сморщиться. Сморщивание нередко устраняют путем повторного добавления вышеуказанной спиртовой смеси. После этого следует вновь выждать процесс испарения, но оно должно идти в более медленном темпе. Для полного обезвоживания сосуд, содержащий нематоды, через несколько дней помещают на 48 ч в эксикатор, заполненный хлоридом кальция или другими гигроскопическими веществами. Далее нематод, находящихся теперь уже в чистом глицерине, переносят на предметное стекло в маленькую каплю глицерина. По периметру покровного стекла раскладывают волокна стекловаты, диаметр которых приблизительно соответствует диаметру нематод. Для заделки препарата края покровного стекла смазывают каким-либо герметизирующим материалом, например лаком для ногтей. Приготовление препарата завершается этикетированием.
Срезы вульвы для определения галлообразующих и цистообразующих нематод

У галло- и цистообразующих нематод, относящихся к родам Meloidogyne, Heterodera и Globodera, рисунок кутикулы вульвоанальной области взрослых самок служит важным признаком при точном определении вида.
В качестве исходного материала для дифференциации видов Meloidogyne используют покрытую галлами растительную ткань, не менее суток фиксированную в 5%-ном растворе формалина. Из этой ткани с помощью скальпеля и иглы извлекают грушевидных самок. Затем под микроскопом, используя острый скальпель или лезвие бритвы, отделяют заднюю часть тела самки, осторожно удаляют внутренности, кладут вогнутой стороной на предметное стекло и накрывают покровным стеклом. Средой для заливки может служить капля лактофенола.
Цисты хранят в капле глицерина. В дальнейшем с помощью острого скальпеля или лезвия бритвы отрезают под стереомикроскопом задний конец, удаляют внутренности и рассматривают препарат как в плане, так и с нижней стороны. Если циста имеет очень темную кутикулу, может потребоваться и продольный срез через воронку вульвы.