Окрашивание по Граму

 26.06.2014

При идентификации многих фитопатогенных бактерий решающим показателем является окрашивание по Граму. Этот дифференцирующий признак основан на различиях в строении оболочки бактериальных клеток. К грамположительным прежде всего относятся виды Corynebacterium, в то время как большинство других фитопатогенных бактерий реагирует на окрашивание отрицательно. Методика окрашивания состоит в следующем.
— Приготовление мазка па обезжиренном предметном стекле, его высушивание на воздухе и фиксирование нагреванием.
— Нанесение на мазок капли карболового раствора генцианвиолета (торговый препарат или 10 мл насыщенного спиртового раствора генциан-виолета + 90 мл 2,5%-ного фенола), инкубация в течение 2—5 мин.
— Сливание красящего раствора и нанесение на предметное стекло раствора Люголя (торговый препарат или 2 г KI растворить в небольшом количестве дистиллированной воды, добавить 1 г йода и довести объем до 300 мл).
— Промывка 96%-ным спиртом (в химическом стакане) до полного исчезновения следов краски.
— Высушивание (иногда не проводится).
— Контрастное окрашивание карбол-фуксином (маточный раствор или его разведения) в течение 1—2 сек. Карбол-фуксин можно заменить 1%-ным сафранином, увеличив время окрашивания до 3—5 мин.
Далее препарат тщательно промывают в водопроводной воде и высушивают на воздухе.
Результаты окрашивания по Граму можно установить только при хорошем освещении (принцип освещения по Кёлеру), используя иммерсионный объектив и полностью открыв диафрагму. Грамположительные микроорганизмы окрашиваются в темно-синий цвет, грамотрицательные — в бледно-розовый или светло-красный.
Примечание. Для контроля качества окрашивания, подбора концентраций красящих растворов и времени окрашивания настоятельно рекомендуется использовать какой-либо вид бактерий с четко выраженной грамположительной реакцией, например Escherichia coli.