07.11.2017
31.10.2017
21.10.2017
21.10.2017
21.10.2017
04.10.2017
04.10.2017
28.09.2017
01.09.2017
31.08.2017
Иммуноферментный анализ (ИФА)
 26.06.2014

ИФА применяют в тех случаях, когда из-за низкой концентрации фитопатогенных вирусов в растениях или наличия в растительных экстрактах веществ, мешающих реакции (фенолы, танины), обычные серологические методы диагностики непригодны.
Высокая чувствительность ИФА дает возможность использовать антиген в высоких разведениях. Этот способ позволяет исключить действие мешающих веществ и получать специфические результаты диагностики вирусов. С 1976 г. с помощью ИФА успешно определяют различные фитопатогенные вирусы. Разработано несколько модификаций метода, например Рихтером с соавт.
Первый этап ИФА — адсорбция антител на поверхности носителя, которые связывают соответствующие антигены из исследуемого раствора. Фиксированный на носителе комплекс антиген — антитела обнаруживают путем добавления антител, меченных ферментом. Затем с помощью подходящего субстрата можно обнаружить комплекс антитела — антиген — меченые антитела (рис. 15). Субстратом служит р-нитрофенилфосфат, а ферментом-меткой — главным образом щелочная фосфа-таза, которую с помощью глутаральдегида конъюгируют с фракциями антисывороток или очищенными антителами. Таким образом, проявление иммунологической реакции связано не с непосредственным выпадением осадка, как при тестах преципитации в жидкой или твердой среде, а с активностью фермента, выражающейся в расщеплении субстрата. Действие фермента заметно даже при малых его количествах, поэтому метод обладает высокой чувствительностью и позволяет обнаруживать антиген либо антитела в минимальных концентрациях.

Иммуноферментный анализ (ИФА)

Методика проведения ИФА в модификации Рихтера с соавт. состоит из следующих этапов:
— в лунки на налете из прозрачного поливинилхлорида вносят по 200 мкл раствора фракции иммуноглобулинов с коэффициентом седиментации 7S в 0,05 M карбонатном буфере с pH 9,6 и инкубируют 3 ч при 37 °C;
— лунки промывают 4 раза фосфатным буфером с NaCl (PBS) и 0,05% твина 20, затем с палет стряхивают капли раствора;
— вносят по 200 мкл гомогената исследуемых проб (в PBS с твином и 2% поливинилпирролидона), разбавленного, как указано ниже; инкубация в течение 18 ч при 4 °C;
— лунки промывают, как указано выше;
— вносят по 200 мкл раствора меченных ферментом антител и инкубируют 4 ч при 37 °C;
— лунки промывают, как указано выше;
— вносят по 300 мкл субстрата (0,06%нный раствор р-нитрофенилфосфата в 10% диэтиламинового буфера, pH 9,8);
— инкубируют при комнатной температуре;
— реакцию останавливают через 80 мин путем добавления 50 мкл 2 н NaOH.
Реакцию обнаруживают по изменению окраски субстрата. Щелочная фосфатаза, конъюгировавшая с антителами, расщепляет р-нитрофенилфосфат с образованием желтого р-нитрофенола. Степень окрашивания зависит от концентрации вируса в образце. Оценку реакций проводят визуально или с помощью спектрофотометра с измерителем экстинкции при длине волны 405 нм.
Примечание. Для диагностики определенных вирусов (например, вируса хлоротической пятнистости яблони) описанная методика требует некоторых изменений: конъюгат вносят в лунку одновременно с исследуемой пробой. В другом варианте ИФА ферментом служит пероксидаза из хрена, а субстратом — ортофенилендиамин. В этом случае реакцию останавливают 4 M серной кислотой и измеряют коричневатое окрашивание субстрата при длине волны 490 нм.
Помимо высокой чувствительности преимущество ИФА состоит в том, что он пригоден для диагностики вирусов любой морфологии. При наличии соответствующего оборудования один лаборант может проанализировать за рабочий день примерно 1000 проб.
Весьма вероятно, что в ближайшие годы ИФА найдет применение для тестирования плодовых деревьев и диагностики вирусов картофеля. Подготовительные работы смогут взять на себя специально оборудованные вирусологические лаборатории, т. е. потребители будут получать уже готовые налеты с адсорбированными в лунках антителами. Тогда для практического применения ИФА потребуются сравнительно небольшие затраты на оборудование.
Поскольку перед проведением ИФА в каждом отдельном случае необходима соответствующая подготовка в специальной лаборатории, более детального описания методики здесь можно не приводить. Все упомянутые буферные растворы готовят по Кларку и Адамсу.