Двойная диффузия (тест Ухтерлони)

26.06.2014

Описанные выше тесты преципитации проводятся в жидкой среде. Однако можно применять и полужидкую среду, например агар, и в этом случае говорят о гель-тесте. Простую форму гель-теста представляет собой двойная диффузия в агаре.
В 100 мл физиологического раствора на водяной бане вываривают до осветления 1 г агара, затем добавляют 50 мг азида натрия для подавления роста микроорганизмов. По 10—15 мл теплого раствора разливают пипеткой в чашки Петри диаметром 9 см, установленные на строго горизонтальной поверхности, чтобы слой агара был равномерным. Чашки должны быть с ровным дном и без царапин, затрудняющих оценку результатов. После затвердения агара при комнатной температуре (лучше выдержать чашки в течение суток) с помощью пробочного сверла диаметром 3—5 мм, соединенного с вакуумным или водоструйным насосом, нарезают отверстия (лунки) по подложенному под чашку шаблону (рис. 11). Для удаления вырезанных дисков агара можно использовать пипетку, соединенную с водоструйным насосом.

Пробы растений, подлежащих исследованию, гомогенизируют в ступке с добавлением фосфатного или какого-то специального буфера, отжимают и вносят в лунки, обозначенные на схеме (рис. 12) буквами АГ. В лунки, обозначенные буквами AC, вносится антисыворотка в рабочем разведении. При заполнении лунок нужно следить за тем, чтобы сок или антисыворотка не переливались через край лунки, это затрудняет считывание результатов реакции. На крышке чашки надписывают наименование проб и антисыворотки. После 24-часовой инкубации в термостате при 24 °С результаты считывают в темном помещении с боковым освещением.
При двойной диффузии также целесообразно использовать в качестве контроля здоровые растения и проводить анализ в нескольких повторениях. При положительной реакции между лунками с антигеном и антисывороткой появляется белая линия или штрих в зависимости от комбинации вирус — хозяин. Реакция происходит в результате диффузии в агар вируса и антител, которые при встрече образуют преципитат.
Линии, расположенные ближе к лунке с антисывороткой или точно посредине между лунками, указывают на неспецифические реакции. С этим связана необходимость включать в анализ контрольные варианты со здоровыми растениями.

Примечание. Как уже указывалось, тест двойной диффузии в первую очередь пригоден для диагностики сферических вирусов. При диагностике палочковидных вирусов с нормальной длиной частиц более 300 нм следует или повысить проницаемость геля путем снижения концентрации агара (0,8%-ный), или разрушить вирусные частицы путем добавления к исследуемому образцу пиридина, пирролидина, детергентов. Слабые линии преципитации можно сделать более заметными путем окрашивания или усилить путем повторного добавления антигена в лунку. Если исследование проводится по не описанной в литературе методике, необходимо в предварительных опытах определить оптимальное разведение антисыворотки и расстояние между лунками с антигеном и антисывороткой.
Тест двойной диффузии может быть использован также для количественных анализов. Агаровые пластинки готовят по схеме, показанной на рисунке 11, с соответствующим расположением лунок. Затем получают различные разведения сока исследуемого растения в фосфатном буфере (от 1:1 до 1:512), которые в порядке возрастания вносят в лунки. Антисыворотку используют в постоянном разведении (примерно на 2—3 ступени ниже титра сыворотки). В обратном случае, т. е. при постоянной концентрации антигена и различных разведениях сыворотки, можно определить ее титр. Антиген вносится в неразведенном виде (соотношение гомогената и фосфатного буфера 1:1). Степень разведения, при которой еще видна линия преципитации, соответствует титру антисыворотки или антигена. Чашки в опытах по определению титра инкубируют в термостате в течение 48 ч.