20.07.2018
20.07.2018
17.07.2018
08.07.2018
22.06.2018
21.06.2018
20.06.2018
19.06.2018
17.06.2018
05.06.2018
Необходимые исследования при стандартизации и испытаниях микробиологических инсектицидов
 21.06.2014

Важные последние достижения в стандартизации микробиологических инсектицидов обусловлены пониманием важности существующих альтернатив и техническим усовершенствованием некоторых методов. В настоящее время только ВТ используется в производственных масштабах достаточно широко, чтобы требовалась международная система стандартизации. Ho очень важно заранее предусмотреть возможные требования других организмов, чтобы при необходимости своевременно ввести хорошо обоснованные системы.
Как правило, имеющиеся методы стандартизации делятся на две большие группы: одну трудоемкую, включающую биоиспытания, и другую — относительно быструю, включающую все методы, за исключением биоиспытаний. Поскольку несомненно желателен быстрый и легкий метод, здесь сначала будут рассмотрены достоинства быстрых методов для испытания различных типов патогенов.
Чистые токсины или препараты, в которых токсин является единственным активным компонентом, представляют простейший тип патогенов. К этой категории относится экзотоксин ВТ, а также кристаллический токсин, когда он используется в чистом виде против тех немногих видов хозяев, против которых он эффективен. Когда будут разработаны специфичные химические методы, они будут наилучшими. Серологическое испытание на кристаллический токсин ценно, особенно при исследовании относительно чистых препаратов, без кондиционирующих добавок, но посторонние примеси и компоненты рецептуры некоторых промышленных препаратов не позволяют пользоваться этим методом. Чтобы установить зависимость между единицами серологического испытания и активностью, метод нужно предварительно калибровать путем биоиспытания. Это не относится к химическим изменениям, поскольку здесь, как и при работе с химическими инсектицидами, единицей измерения служит вес активного компонента.
Следующая группа включает патогены, которые плохо прорастают с образованием колоний на агаре и оцениваемые методом подсчета частиц. В эту группу входят вирусные полиэдры, бактерии группы Bacillus popilliae, простейшие, многие грибы и нематоды. Недостаток метода подсчета частиц заключается в том, что при нем не делается исключения для отмерших или поврежденных частиц и его нельзя применять после добавления порошковидных компонентов препарата. Быстродействующий счетчик Коултера можно применять только для значительно более чистых микробиологических препаратов, чем те, что может производить промышленность, и в сочетании с микроскопической проверкой жизнеспособности при подсчете нематод. За исключением некоторых нематод, эту группу патогенов производят главным образом in vivo, и поэтому опасность ослабления исходных линий маловероятна.
Следующая группа патогенов развивается в лабораторных условиях, не образуя токсины. В нее входят некоторые бактерии и грибы, и для них можно применять подсчет живых спор или частиц. Подсчет живых спор выявляет гибель активных спор, но ни один метод не позволяет выявить ослабление, поражение фагами или различные стадии покоя.
Последняя группа состоит из грибов и кристаллоносных бактерий, образующих токсины in vitro. Здесь снова можно применять подсчет живых спор или частиц при тех же ограничениях, о которых говорилось выше, и учитывая, что эти методы непригодны для измерения неодинаковой продукции токсина.
В хорошо проверенном и изученном промышленном процессе, при тщательном контроле субстрата и условий, эти быстрые методы могут давать вполне надежные оценки активности, :в большой мере зависящие от опыта и сообразительности персонала. Однако эта оговорка и вышеуказанные факторы вносят элементы ненадежности, нетерпимые в отношении промышленного продукта. В этом случае требуется метод, лишенный этих недостатков, и единственным таким методом является только трудоемкое биоиспытание. Для нематод хороших методов испытаний не разработано, и пока приходится полагаться на подсчет частиц. Методики испытания грибов требуют изучения.
Результаты биоиспытаний необходимо выражать в тех же произвольных единицах, в которых выражена активность конкретной партии материала, принятой в качестве стандарта. Это надежная и простая система для специфического по виду хозяина патогена, например вируса, или патогена широкого спектра действия, используемого против видов насекомых, включенных в испытание.
Таким образом, каждый из различных методов стандартизации находит применение. Как правило, первым этапом является контроль условий производства для обеспечения прогнозируемого выхода продукта, затем проверка качества каждой партии одним из быстрых методов и наконец биоиспытания для оценки активности больших партий продукта, объединяемых перед сбытом. Биоиспытание дает окончательную информацию, на основании которой продукт доводится до объявленного уровня активности путем добавления нужного количества инертного компонента. Для ВТ весь процесс в целом показан на следующей схеме.

Необходимые исследования при стандартизации и испытаниях микробиологических инсектицидов

Будущие тенденции в стандартизации микробиологических инсектицидов зависят от того, насколько возрастет их потребление. В настоящее время стандартизация проведена в немногих активных промышленных фирмах, поддерживающих уровень активности препаратов, соответствующий дозам, рекомендуемым для применения каждой из фирм. Сильное расширение использования патогенов потребует согласованных методов, чтобы создать основу для сравнения различных продуктов. Это легко достижимо для специализированных патогенов, но для патогенов широкого спектра действия подобных ВТ, наиболее освоенного промышленностью, связано с трудностями.
Эти трудности возникают в связи с тем, что выраженные в стандартных единицах результаты биоиспытания, полученные с одним видом хозяина, часто неприемлемы к другому виду хозяина. Это может происходить, когда рецептура испытываемого препарата отличается от рецептуры стандартного препарата или, еще вероятнее, если в этих двух препаратах использованы разные штаммы и один из штаммов по природе более активен в одном виде хозяина, чем в другом. Это не удивительно, поскольку можно ожидать приспособления в природе различных штаммов патогена к конкретным видам хозяев. Можно провести также аналогию с химическими инсектицидами: относительная активность двух химических препаратов часто изменяется по отношению к разным видам насекомых.
В связи с этим встает вопрос о том, какой вид насекомого следует выбирать для испытаний. Выбирать, очевидно, нужно того вредителя, против которого больше всего применяется данный патоген, при условии, что этот вид удобен методологически. Если он непригоден, следует выбирать другой, аналогично реагирующий на патогена. Постепенно можно накопить сравнительные данные по другим вредителям и применять такие дополнительные виды подопытных насекомых, если они потребуются для получения информации о тех видах, которые существенно отличаются от основных подопытных видов. Это уже делается, но отдельными промышленными фирмами. Если использование микробиологического инсектицида сильно расширится, им могут заняться несколько фирм. Поскольку против Trichoplusia ni чаще всего используют ВТ и одновременно она — одно из лучших насекомых-тестеров, легко разводится, не считается карантинным объектом во всех странах и может развиваться на стандартной искусственной среде для биоиспытаний, ее можно, видимо, считать хорошим универсальным насекомым-тестером. Вторым кандидатом для дополнительных испытаний является Ephestia kuehniella, поскольку этот вид космополитичен и методологически даже более пригоден для испытаний, чем Trichoplusia ni. Оба вида пригодны для измерения активности комплекса спора—кристалл. Для измерения активности экзотоксина, поражающего гораздо более широкий круг насекомых, необходим другой вид. Однако ситуация все время меняется, потому что фирмы то и дело вводят в производство новые штаммы с повышенной активностью. Степень этого улучшения различна для разных видов хозяев, и в отношении некоторых видов активность патогена может даже снижаться. Кроме того, с помощью генетических методов желательные признаки насекомых признанных штаммов могут быть объединены в одном искусственном штамме, который не будет знаком никому, кроме его создателя, а круг его хозяев не будет походить ни на какой другой из числа известных. Практическим выходом из такого положения может служить большее доверие потребителя к компетентности фирмы, выпускающей микробиологические инсектициды широкого спектра действия, чем то, которого в настоящее время ожидают в отношении химических средств.
Как бы то ни было, задачей науки является обеспечение оружия, если оно нужно практике. Сейчас исследования целесообразнее всего направить на изучение точности.
Точность, достижимую в отличие от практически достигнутой при нормальной затрате труда можно найти в таблице 56 между примерами (1) и (2) для подсчета колоний (3) и (4) или (5) — для подсчета частиц в счетных камерах и (8) и (10) — для биоиспытаний. Образцы промышленных препаратов содержат слишком много инертных частиц, чтобы можно было пользоваться счетчиком Коултера. Однако подсчеты частиц и живых спор и биоиспытания имеют общую черту — сильное расхождение между результатами, полученными в последнее время в разных лабораториях. Если в практике будут применять сравнительные испытания, то в различных лабораториях должны получать совпадающие результаты. К счастью, затруднения легко устранимы.
Главными причинами непостоянства результатов подсчетов частиц в счетных камерах являются колебания в фактической глубине слоя жидкости в камере и в способности разных лаборантов распознавать нужные частицы. Эти затруднения можно преодолеть, измеряя при помощи интерферометра глубину слоя в камере при каждом ее использовании и путем разработки камеры, пригодной для работы с иммерсионным объективом. В последнем случае проблемами являются толщина покровного стекла и притяжение иммерсионного масла, сдвигающее покровное стекло. Эти проблемы можно, вероятно, разрешить, сконструировав длинную, но узкую камеру с тонким закрепленным покровным стеклом. Каждую камеру придется калибровать, пользуясь интерферометром, и, если по длине камеры обнаружатся значительные колебания в глубине, можно взять среднюю и подсчеты всегда производить вдоль длины платформы. Непостоянство результатов подсчетов живых спор обусловлено главным образом использованием различных смесителей, чего, вероятно, можно избежать, используя дешевые стандартные стеклянные гомогенизаторы.
Разница в результатах биоиспытаний вызвана кумулятивным различием многих деталей методики. Избежать этого можно путем стандартизации методики до мельчайших деталей. Так, например, можно рассылать разным лабораториям образцы одной и той же партии корма и одной и той же линии насекомых; можно стандартизировать температуру, влажность, длину дня, контейнеры, аппараты (особенно гомогенизаторы), размеры насекомых и т. д.
Одним из преимуществ использования искусственной среды является возможность выращивать на ней несколько видов насекомых, что позволяет сравнивать различные специфические по виду хозяина патогены на их конкретных насекомых-хозяевах в идентичных условиях. Игноффо и Гарсия сравнили таким путем патогенность пяти вирусов ядерного полиэдроза в их соответствующих хозяевах.
Исследования концентрируются вокруг разработки новых методов и совершенствования уже существующих. Особого внимания заслуживают следующие предложения.
1. Конструирование счетной камеры, используемой с иммерсионным объективом.
2. Дальнейшее изучение методов автоматического электронного подсчета.
3. Поиски метода испытания жизнеспособности спор Nosema in vitro.
4. Разработка химического метода испытания экзотоксина ВТ.
5. Исследование серологического метода испытаний некоторых вирусов.
6. Определение степени пригодности метода стандартизации комплекса спора — кристалл ВТ с использованием выбранного вида насекомого-хозяина для других видов вредителей.
7. Проведение межлабораторных проверок воспроизводимости: а) подсчетов частиц; б) подсчетов живых спор; в) биоиспытаний ВТ, проводимых с одним видом хозяина по единой, точно контролируемой методике.
8. Разработка быстрого метода проверки статистической достоверности отношений активностей в развитие методов Личфилда и Вилкоксона.
9. Разработка методики специальных испытаний, например определения пригодности препарата ВТ для применения в особых условиях пчелиного улья.
10. Разработка быстрого метода измерения активности отдельных бактериальных колоний при исследованиях мутантов.