07.11.2017
31.10.2017
21.10.2017
21.10.2017
21.10.2017
04.10.2017
04.10.2017
28.09.2017
01.09.2017
31.08.2017
Практические аспекты методики биоиспытаний микробиологических инсектицидов
 21.06.2014

Новейший опыт биоиспытаний патогенов выявил некоторые способы более легкого получения менее изменчивых результатов. Важнейшим фактором уменьшения колебаний является строжайший контроль физиологического состояния насекомых и условий во время их выращивания и заражения патогеном. Во время выращивания важны пища, температура, влажность, плотность популяции и иногда фотопериод. Размеры личинок обычно стандартизируют, отбирая особей одного возраста, выращенных в строго контролируемых условиях. Гусеницы некоторых видов, например у вощинной огневки (Galleria mellonella), растут неодинаково быстро, даже если это потомство одной матери, несмотря на строго контролируемые условия. У таких видов личинок одинакового размера нужно отбирать визуально или по весу. В ряде случаев работа по взвешиванию оправдывается, потому что дает возможность определить дозу патогена на 1 г веса тела насекомого.
При биоиспытаниях инфекция должна проникать в организм насекомого тем же путем, как и в поле. Для стандартизации микробиологических инсектицидов инъекции патогенов в полость тела насекомых совершенно бесполезны.
Испытания лучше всего проводить на стадии развития насекомого, наиболее сильно поражаемой патогеном. Используя личинок, следует выбирать самые молодые возрасты, с которыми можно работать при низкой естественной смертности. Часто легче работать с яйцами; так, например, некоторое число свежеотложенных яиц Ephestia kuehniella помещают на слой подсушенного теста, содержащего патоген, так что гусеницы с момента отрождения соприкасаются с патогеном и позднее можно легко и точно подсчитать выживших и погибших особей.
Ряд критериев дает очень сходные, но более устойчивые показания активности, чем при учете смертности. Так, при испытаниях ВТ можно использовать в качестве критерия паралич шелковичных червей и фотометрическое измерение количества пищи, поглощенной гусеницами Pieris brassicae.
При заражении через рот доза патогена, поглощенная каждым насекомым, зависит от количества съеденного корма. Аппетит личинок в разные периоды каждой возрастной стадии крайне изменчив. В идеальном случае личинок следует использовать через одно и то же время после линьки, но, поскольку это обычно нецелесообразно, нужно по крайней мере выбраковывать тех, которые явно находятся в состоянии, предшествующем линьке или после нее. Пендлтон нашел, что зеленая окраска у личинок 3-го возраста Philosamia cynthia var. ricini через 2—3 дня после линьки изменялась на белую при очень постоянном весе тела (58—62 мг). Аппетит гусениц Р. brassicae колебался даже при измерении его через постоянное время после линьки; колебания в доле листовых дисков, съеденных отдельными гусеницами из восьми различных партий, составляли от 40±10 до 11±10 (средний процент±средняя квадратичная ошибка).
При некоторых методах предусмотрен период голодания личинок перед их обработкой, но мнения о ценности этого приема расходятся. Голодание повышает восприимчивость к ВТ и гарантирует поглощение корма всеми гусеницами, но колебаний аппетита оно не уменьшает.
Состояние корма влияет на его поедание насекомыми. Листья всегда должны быть свежими и одинаковой толщины. Голембовская получила очень разные ЭД50 для только что отродившихся гусениц Е. kuehniella, которым она скармливала порошковые препараты ВТ, смешанные с сухой мукой, или те же препараты, смешанные сначала с мучной пастой, затем высушенные и размолотые, хотя при определении отношения активностей различия в значительной степени исчезали. Преимущество искусственных сред в том, что их легче воспроизводить, чем листья, но при этом необходимо тщательно проверять устойчивость патогена в среде и избегать добавления антибиотиков или консервирующих веществ, если они действуют на патоген. Такие среды можно использовать в автоматизированных системах, где много гусениц приходится содержать по одной.

Очень важно равномерно распределить микробиологический инсектицид в корме насекомых. Нужны такие же меры предосторожности, как и при подготовке суспензий патогенов для подсчета (раздел III, А). Если для распределения капель применяют шприц, желательно избежать оседания частиц путем, например, магнитного перемешивания суспензии в самом шприце. После обработки листьев или иных поверхностей, например пчелиного воска, суспензии нужно быстро подсушить, чтобы предупредить их порчу, которая может быть вызвана прорастанием спор при медленном высыхании. Погружение обеспечивает хорошее распределение должным образом составленных суспензий на листьях с нежным опушением, если после погружения листья встряхивают и высушивают, разложив черешками вниз, чтобы предупредить высыхание капель суспензии на кончике листа. Листья с гладкими восковыми поверхностями следует обрабатывать тонко распыляемой жидкостью без стекания, предварительно размешав отмеренный объем суспензии в масле в бачке опрыскивателя или в воде в камере. Направленное опрыскивание определенным объемом, например, из пульверизатора дает менее удовлетворительные результаты вследствие различного отскакивания капель при ударе о листья и колебаний в количестве препарата, не попадающего на листья. Пендлтон нашел, что добавление небольшого количества чистого агара (0,25%) к суспензии чистых кристаллов ВТ способствовало растеканию суспензии на листьях и равномерному высыханию ее на воздухе при 30 °С. Суспензии можно очень равномерно размешать в искусственной среде, застывающей при охлаждении, или в клейкой жидкой фракции питательной среды для Galleria, которой, кроме того, очень равномерно глазируют хлопья зерновых. Кислотность меда (pH 4) в этой среде предотвращает преждевременное прорастание спор ВТ. Порошковидные препараты можно успешно примешивать к муке или к сыпучей среде, сочетая обработку в ступке с перемешиванием в барабанной мешалке. Можно опрыскивать суспензией муку при постоянном помешивании, а затем продолжать смешивание, как описано для порошков. Очень хорошего смешивания можно добиться в жидкостях или в пастах, которые затем высушивают в тонком слое; однако во время сушки может происходить частичное разделение или осаждение.
При испытаниях препаратов ВТ вопрос о количестве пищи плюс патоген, поглощенном насекомым, усложняется присутствием кристаллов, вызывающих быстрый паралич ротовой области и кишечника, что приводит к прекращению питания. Сгруппировав на графике полученные данные в соответствии с количеством патогена, фактически съеденным каждым насекомым, Роджерс, не изменяя наклона прямой, сильно уменьшил рассеивание экспериментальных данных по сравнению с нанесением тех же данных в зависимости от концентрации суспензии патогена, которой обрабатывали корм. Уайт нашел, что для Galleria mellonella данный метод непригоден, поскольку он сильно уменьшает наклон кривой.
Количество поглощенного патогена можно измерить различными способами. Лаан и Геест (частное сообщение) наносили отмеренное количество суспензии патогена на небольшие диски, вырезанные из листьев. Каждая личинка получала один диск, и тех, что недостаточно быстро съедали весь корм, выбраковывали. Применяя улучшенную модификацию этого метода, Гибсон и Галовалья (частное сообщение) опрыскивали суспензией бактерий в капустном соке тупые верхушки (3*4 мм) небольших треугольников из капустных листьев. Каждую подсохшую верхушку вставляли через щель в основание небольшой пластмассовой чашки, и личинка поедала ее в течение 5 мин. Личинки заглатывают каплю суспензии, нанесенную шприцем на их ротовые органы, или же эту каплю можно скормить принудительно, вводя иглу шприца в ротовую полость или в анальное отверстие (Норрис, частное сообщение). То, что личинки получают всю дозу в одной концентрированной порции, не имеет значения для испытаний по стандартизации. Принудительное кормление вызывает некоторый шок, и каждую личинку, отрыгнувшую супензию, следует выбраковывать. Шелковичных червей, физически пострадавших при принудительном скармливании бактериальных суспензий, легко распознать по быстрому обесцвечиванию, вызванному септицемией или добавлением 4000 спор ВТ на личинку к инокулумам для контрольных экземпляров. Роджерс и др. добавляли изотоп фосфора (Р32 в форме ортофосфата в разведенной HCl) к суспензии, которой они обрабатывали листовые диски. Количество поглощенной суспензии вычисляли, исходя из остаточной радиоактивности несъеденной части листа. Ho Роджерс установил, что распределение растворенной соли P32 на листьях отличалось от распределения взвешенных частиц. Он устранил разницу, добавляя к раствору соли P32 3% полизтиленгликоля (Карбовакс «6000»). Это соединение способствует равномерному высыханию. Уайт использовал радиоизотоп в опытах с G. mellonella на рамках с расплодом медоносной пчелы. Чаутхани добился полного поглощения всей дозы патогена, заливая поверхность искусственной среды толстым слоем расплавленного парафина, в который до его охлаждения вставлял стеклянную палочку такого же диаметра, как тело личинки. После удаления палочки в парафине оставалось отверстие, в которое вносили требуемую дозу патогена. Вбуравливаясь в корм, личинка была вынуждена съесть всю обработанную патогеном часть среды.
Необходимо отметить некоторые общие меры предосторожности. Гусеницы некоторых видов склонны к каннибализму или питаются трупами, вследствие чего их приходится содержать по одной в картонках, например Heliothis zea, или в желатиновых капсулах диаметром 8 мм и длиной 24 мм, например Galleria mellonella. Продолжительность экспозиции должна быть минимальной, чтобы эффект мог проявиться у большинства насекомых, поскольку изменчивость с течением времени склонна возрастать. Следует избегать таких систем, которые позволяют гусеницам уходить с обработанного корма или сваливаться с него. Наблюдение за действием препарата должно быть достаточно легким. В сомнительных случаях насекомых относят к мертвым, если они не реагируют на прикосновение, а для видов, способных притворяться мертвыми, нужно применять легкий подогрев. Некоторых насекомых, например Е. kuehniella, бывает трудно обнаружить, потому что они зарываются в субстрат; в этом случае можно использовать очень тонкий слой среды. Добавив к смеси муки и порошка дрожжей 10% глицерина, можно сделать ее пригодной для других бабочек—вредителей запасов и улучшить прилипание корма к стеклу.
До сих пор обсуждение более или менее относилось к вирусам, образующим включения, спорообразующим бактериям и простейшим, поскольку все эти патогены могут передаваться через рот. Использование грибов еще не достигло той стадии, когда требуется стандартизация препаратов, а что касается биоиспытаний, то проблемой пока остается относительное значение заражения через рот, через кутикулу и через дыхальца. Биоиспытания грибов обсуждались ранее. В настоящее время наилучшим решением, вероятно, является внесение спор в среду обитания подопытных насекомых, т. е. в корм для вредителей запасов, в почву — для почвообитающих насекомых и в воздух — для листогрызущих видов, при условиях (особенно увлажнения), кажущихся оптимальными для грибов. Опыливание под вакуумом не следует применять, поскольку опоры при снятии вакуума неестественно втягиваются в дыхальца.
При планировании испытаний нужно сначала решить вопрос о числе концентраций, интервале между ними и о числе насекомых. Решение прежде всего зависит от возможности предугадать активность препарата и восприимчивость насекомых. Лучше сначала провести небольшое предварительное испытание очень различающихся концентраций или, наоборот, многих концентраций. В конечном испытании наиболее весомы точки, наиболее близкие к ЭД50, причем хотя бы одна из них всегда будет выше или ниже ЭД50. В идеале точки должны размещаться в пределах смертности от 15 до 85%: к этому нужно стремиться без ненужного риска проглядеть диапазон активных концентраций.
Для обычных целей результаты испытаний можно оценить за несколько минут, нанеся на логарифмическую бумагу зависимость между процентом смертности и дозами для стандартного и испытуемого образцов и получив отношения активностей при ЭД50. Опыт авторов показал, что в некоторых испытаниях кривые склонны изгибаться при низкой смертности, из чего следует, что этим значениям следует уделять меньше внимания. Личфилд и Вилкоксон предложили быстрый приблизительный метод определения доверительных пределов ЭД50, отношений активностей и наклона кривой (в том числе для гетерогенных данных), достаточно точный для большинства целей. В публикуемых работах всегда должны быть указаны доверительные пределы.