01.09.2017
31.08.2017
08.08.2017
14.07.2017
06.07.2017
19.06.2017
19.06.2017
19.06.2017
15.06.2017
12.06.2017
Серологические испытания микробиологических инсектицидов
 21.06.2014

Количество кристалла в препарате комплекса опора — кристалл ВТ можно определить но его реакции со специфической антисывороткой по методу диффузионной преципитации в геле. Полное описание этого метода, который разработали Чепмен, Кингхем и Норрис, нигде не опубликовано, поэтому мы приводим его ниже.

Методика

Испытание проводится на лотках. Каждый лоток содержит шесть рядов из семи ямок, образованных в результате склеивания листа перспекса (органического стекла) толщиной 3 мм с другим листом толщиной 1,5 мм, в котором просверлены отверстия диаметром 15 мм.
Антиген приготовляют, суспендируя отвешенное количество препарата опор и кристаллов в стандартном буферном растворе. Основной раствор буфера готовят, смешивая по порядку по 125 мл 0,4 M водных растворов Na2CO3, 2-амино-2-метилпропанола, NaH2PO4*2H2O и лимонной кислоты; затем добавляют 3,4 мл восстановителя 2-меркаптоэтанола, доводят 1 M NaOH конечный pH до 10,0 и дистиллированной водой доводят объем до 1 л. Этот основной раствор попользуют при разведении 1:8. Важно снова отрегулировать pH буферного раствора после добавления бактерий, прежде чем помещать его на ночь на качалки для растворения всех кристаллов. Антигеном является надосадочная жидкость, получаемая после центрифугирования; ее можно хранить в замороженном виде.
Антисыворотку получают, инъецируя кроликам суспензии спор и кристаллов или щелочные растворы кристаллов.
Антисыворотку вводят в чистый агар, например Ion agar № 2 (фирмы Oxoid Ltd.). Равные объемы 2%-ного (вес/объем) агара в воде и универсального буферного раствора двойной концентрации с pH 10 смешивают при 50 °С, затем, при постоянном помешивании добавляют 5% (по объему) антисыворотки. Нагретой пипеткой смесь разливают в ямки на перспексовом лотке. После охлаждения в центре агаровых дисков трубкой из нержавеющей стали с острыми краями вырезают углубление диаметром 3 мм. Антиген разводят в арифметической прогрессии универсальным буферным раствором и, пользуясь шприцем Гамильтона, заполняют по два углубления в агаре каждым разведением, начиная с самого сильного. Одновременно проводят такую же операцию с контрольным стандартным препаратом. Если раствор антигена переполнит какое-либо углубление, его выбраковывают и заполняют антигеном другое. Затем лоток помещают на 48 ч в термостат в атмосферу, насыщенную влагой, после чего измеряют диаметр наиболее удаленных от центра колец преципитации. Если в стандартном и в испытуемом материале образуется разное число колец, следует провести испытание на гомологию. Для этого в агаре, налитом в небольшую чашку Петри, делают углубления, центральное заполняют иммунной сывороткой, а периферические— антигенами. Измеряют кольца, которые сливаются, причем это не всегда будут самые удаленные от центра.
Кольца легче всего измерять с помощью окуляр-микрометра под препаровальным (бинокулярным) микроскопом. При нанесении на график зависимости между диаметром колец и логарифмом концентрации, между диаметрами 5,7 и 9,6 мм получается прямая линия. Концентрацию антигена в неизвестном препарате можно сравнивать с концентрацией его в стандарте по отношению обратных величии наклонов кривых. Можно также построить график зависимости квадрата диаметра от концентрации антигена. Это также пропорциональная зависимость.
Значение метода

Описанный метод дает очень точные и воспроизводимые результаты при испытании чистых препаратов комплекса спора — кристалл, но при наличии загрязнителей результаты ухудшаются. Авторы установили, что он непригоден для промышленных препаратов, содержащих вещества, защищающие кристаллы от ультрафиолетовых лучей, вероятно, вследствие маскирующего действия этой добавки. При успешном серологическом испытании количество кристалла в смеси спор и кристаллов измеряют в произвольных единицах одного из антигенных компонентов. Эти единицы можно калибровать в единицах веса целого кристалла путем испытания раствором антигена, содержащим точно известное количество чистого кристалла. Последующие партии антисыворотки следует калибровать заново.
В особых случаях серологические испытания позволяют косвенно измерить патогенность. Серологические единицы можно калибровать по данным биоиспытаний, в которых один и тот же штамм бактерии используется против насекомого, восприимчивого к действию только кристалла, например Pieris brassicae и Bombyx mori. Эта зависимость строго ограничена подобными случаями. Если на патогенность каким-то образом влияют споры, то увязать этим путем серологические и биологические испытания уже невозможно. Когда требуется сравнение, необходимо обеспечить выращивание насекомых для биоиспытаний в строго контролируемых условиях, поскольку некоторые кишечные бактерии, преобладающие в субоптимальных условиях разведения, могут убивать личинок, ослабленных поглощением доз кристаллов, сублетальных в нормальных условиях.