07.11.2017
31.10.2017
21.10.2017
21.10.2017
21.10.2017
04.10.2017
04.10.2017
28.09.2017
01.09.2017
31.08.2017
Подсчеты живых организмов
 21.06.2014

Разведенную суспензию живых организмов вносят в соответствующую питательную среду для образования колоний; их подсчитывают, предполагая, что каждый живой организм образует одну колонию. В настоящее время этот метод применим только в отношении бактерий и грибов, способных развиваться in vitro на агаровых средах. Для вирусов можно использовать также однослойные культуры клеток при условии, что последние сохраняются достаточно долгое время, чтобы успели развиться хорошо заметные колонии. Живые споры простейших, например Nosema, можно было бы подсчитывать под микроскопом, если бы удалось найти эффективный химический или физический способ проращивания всех опор образца.

Приготовление суспензий

Прежде чем вносить суспензию бактерий или грибов в питательную среду, нужно развести ее до уровня, пригодного для развития ясно заметных колоний. Для этого пригодны разведения сначала 1:100 и затем 1:10. Как правило, три последних разведения высевают в четырех повторностях. Для каждого разведения необходимо пользоваться другой пипеткой. Перед отбором пробы суспензии ее нужно встряхивать не меньше 30 раз. Наполнив пипетку, нужно коснуться ее кончиком стенки колбы, чтобы удалить жидкость с ее наружной поверхности. Внося суспензию, следует держать конец пипетки на 1 см выше поверхности среды, но никогда не касаясь ее. Через 3 сек после выдувания пинетки нужно вторично продуть ее, чтобы удалить жидкость, скопившуюся в капилляре.
Суспензии бактериальных опор нужно подвергать тепловому воздействию, например выдерживанию при 65°C 15 мин, чтобы вывести споры из состояния покоя. Грибные споры прорастают иногда через разное время. Посев на предметные стекла позволяет обнаруживать медленно прорастающие споры. Мюллер-Кёглер и Самшинакова рекомендуют принять в качестве стандарта для конидий и бластоспор Beauveria bassiana процент прорастания через 24 или 36 ч.
Посев

Из различных способов посева спор микроорганизмов, образующих заметные колонии под поверхностью прозрачной агаровой среды, наилучшим является метод заливки чашек Петри. В каждую чашку вносят пипеткой 1 мл суспензии, затем, не давая ей высохнуть, добавляют около 12 мл среды, нагретой до 45°С, и сейчас же перемешивают, производя с этой целью шесть круговых движений по часовой стрелке, шесть — против часовой стрелки, шесть движений вперед и назад и наконец шесть — из стороны в сторону. Агар застывает и подсыхает, после чего чашки с посевом перевертывают и инкубируют (для ВТ в течение ночи при 30°C). Подсчет производят в чашках, где развилось от 30 до 300 колоний. Существуют различные приспособления, облегчающие подсчет.
В других случаях для подсчета многих грибов и бактерий, колонии которых лучше развиваются на поверхности агара, 0,5 мл суспензии распределяют по поверхности агара в хорошо высушенных чашках. Мюллер-Кёглером описаны различные методы подсчета грибов.
Точность подсчета частиц и живых организмов

При подсчетах возможно два типа ошибок: те, что связаны с произвольной выборкой проб суспензии и связанные с методикой. Наиболее важны кумулятивные систематические ошибки и любые другие, намного превышающие все остальные.
В таблице 56 классифицированы оценки точности 19 примеров, главным образом связанные с неизбежными ошибками рендомизированной выборки при нормальной затрате труда (колонка 2) я другие, связанные с различными систематическими или крупными ошибками (колонка 3), например ошибками, связанными с разницей в оборудовании и методах, используемых разными работниками, или с трудностями, обусловленными загрязненностью промышленных микробиологических инсектицидов.
Поскольку рендомизированная выборка применяется при всех методах стандартизации, нужно прежде всего определить ее влияние на точность. Численность частиц, организмов или колоний подчиняется распределению Пуассона, и, следовательно, стандартная ошибка (s), обусловленная рендомизированной выборкой, равна корню квадратному из общего числа. Если ее рассматривать как долю целого, s быстро уменьшается по мере увеличения подсчетов до 400, после чего скорость уменьшения s сильно снижается. Поэтому нужно подсчитать не меньше 400 единиц. Доверительные пределы, включающие 95% повторностей, составляют около ±1,96 s от полученного числа, например 400±39, или в процентах 100±10% (табл. 56, пример 1). Колебания в подсчетах живых организмов часто хорошо согласуются с этими теоретическими величинами, хотя Бухер и Морзе получили для Pseudomonas aeruginosa более широкие колебания, потому что часто подсчитывалось меньше 400 колоний в повторности, а между чашками имелись необъяснимые колебания (табл. 56, пример 12).
Подсчеты живых организмов

Все методы оценки патогенов включают измерения объема жидкости, в которой взвешены организмы. Точность переноса проб пипеткой и других операций в большой мере зависит от работника и поэтому совершенно непостоянна. Наиболее важны систематические ошибки. Систематическая 1%-ная ошибка при шести десятикратных разведениях может привести к ошибке в 6% при подсчете в конечном разведении. В сочетании с 5%-ной ошибкой усреднения при подсчете 400 колоний это увеличит ошибку до √5в2+6в2=7,8% и расширит соответствующие пределы колебаний с 100±10 (табл. 56, пример 1) до 100±15. Тем не менее Снайдер считал, что ошибки при отборе проб пипеткой не могут иметь значения при подсчете колоний, как, вероятно, и при других методах подсчета.
Очень важно контролировать изменчивость. Эйзенхарт и Уилсон предложили быстрый метод определения отклонений от случайных колебаний между осями при стандартных методах подсчета живых опор, и этот же метод можно использовать для подсчета частиц.
Колебания численности живых спор в порошковых препаратах ВТ часто значительно превышали случайные отклонения (табл. 56, пример 2). Однако исследование выявило гораздо более серьезное влияние трудности разделения агрегатов (комков) спор и сухого вещества продуктов ферментации. Для трех порошковых препаратов ВТ, высеянных в чашки 13 различными людьми в семи странах по стандартной методике с использованием смесителей, средняя численность живых спор колебалась от 8,7*10в9 до 545*10в9. Самое большое расхождение было между лаборантами, вероятно, в связи с использованием разных смесителей. При включении в ошибку расхождений между лаборантами пределы колебаний средней из четырех повторностей (чашек) были невероятно широки (табл. 56, пример 13). Такие результаты можно улучшить.
При подсчете частиц в счетных камерах большое влияние на фактический объем суспензий в камерах оказывает неодинаковое наложение покровного стекла. Норрис и Поузлл пришли к выводу, что при наилучших условиях возрастание фактической ошибки, обусловленной всеми причинами, не должно превышать 50% случайной ошибки (табл. 56, пример 3). Однако они нашли, что если ошибка не обнаружена, она будет систематически сильно завышать оценку (табл. 56, примеры 14 и 15).
При подсчетах частиц в счетных камерах причиной колебаний могут оказаться как загрязнители, так и лаборанты (в частности, неодинаковое наложение покровного стекла). Подсчеты нематод, (проведенные одним лаборантом (табл. 56, пример 4, подсчет в открытой чашке), имели более широкие пределы колебаний, чем у Норриса и Поуэлла при подсчете бактерий в идеальных условиях (табл. 56, пример 1), широкие пределы поолучил один лаборант при 15 (подсчетах вирусных полиэдров (табл. 57; табл. 56; пример 5, подсчет в камере). Последние подсчеты явились частью организованных Игноффо межлабораторных сравнений трех сухих препаратов вируса ядерного полиэдроза, содержавших около 85—95% остатков тканей хозяев и примерно 5—15% полиэдров. Несмотря на попытку стандартизировать оборудование и методику, люди большей частью пользовались своей обычной методикой. В этой работе использовались не типичные промышленные препараты, а лабораторные партии, которые не были очищены от частиц тканей хозяина. Колебания между лаборантами и между лабораториями (табл. 57) привели к недопустимо широким пределам расхождений для каждого отдельного подсчета (табл. 56, пример 16). В другой серии испытаний два квалифицированных лаборанта в разных лабораториях, подсчитывая вирусные полиэдры в одних и тех же шести неочищенных препаратах вируса, получили средние числа 54*10в8 и 23*10в8. При статистическом анализе, с внесением поправки только на ошибку, обусловленную лаборантами, пределы колебаний отдельного подсчета оказались крайне широкими (табл. 56, пример 17). Отсюда ясно видно, что ошибка лаборанта очень велика и полагаться на результаты этих подсчетов нельзя, пока действия персонала не будут синхронизированы и не будет достигнута договоренность о поправке на неодинаковое положение покровного стекла. Споры (но не кристаллы) ВТ в жидких промышленных препаратах можно более точно подсчитывать, пользуясь счетными камерами в фазово-контрастном микроскопе, чем в окрашенных мазках, но менее точно, чем при подсчете живых спор. Кристаллы в таких препаратах можно подсчитывать только в окрашенных мазках, но точность таких подсчетов невысока. Считать под микроскопом опоры и кристаллы в порошковидных препаратах невозможно.
Подсчеты живых организмов

Большие количества чистых частиц, например 75 000, можно быстро и легко подсчитать счетчиком Коултера, сильно уменьшив, таким образом, пределы колебаний. Мартиньони и Иваи получили хорошие результаты с очищенными вирусными полиэдрами, содержащими не более 7,9% частиц загрязнителей того же размера, что и полиэдры (табл. 56, пример 6). При 17,1% загрязнителей численность при подсчете с микроскопом составляла в среднем лишь 51,4% от численности, определенной счетчиком Коултера. Если выразить 51,4% и значения, полученные в счетчике Коултера (100%), в процентах от их средней (75,7%), то получается совершенно неудовлетворительный предел 68—132% (пример 18 в табл. 56), не выдерживающий сравнения с пределами в нижней части второй колонки таблицы. Тем не менее подсчет в счетчике Коултера неполовозрелых стадий нематоды Nsoaplectana carpocapsae (ДД-136) (табл. 56, пример 7) неизменно давал менее колеблющиеся результаты, чем визуальные (пример 4).
Если рассматривать вопрос о точности в целом, то 2-я графа таблицы 56 показывает, каких результатов можно достигнуть при хорошо контролируемых системах. В 3-й графе показано влияние некоторых важных источников ошибок, особенно вероятных, когда в работе участвуют больше чем один лаборант или лаборатория.