07.11.2017
31.10.2017
21.10.2017
21.10.2017
21.10.2017
04.10.2017
04.10.2017
28.09.2017
01.09.2017
31.08.2017
Общие методы разведения патогенов членистоногих в живых системах
 21.06.2014

Культура органов тканей и клеток насекомых требует асептических условий. Всю стеклянную посуду, среды и оборудование необходимо стерилизовать. Клетки насекомых, как и многие культивируемые клетки, чувствительны к действию ингибиторов роста, поэтому стеклянная посуда должна быть химически чистой, а при составлении сред следует использовать дистиллированную воду.
Первичные эксплантаты выращивали в висячих или стоячих каплях, простых и центрифужных пробирках, в колбах на качалках, T-образных колбах или в полистероловых колбах разового пользования. Оптимальная для роста клеток температура была 26—30°C. Перед вскрытием и извлечением эксплантируемых тканей поверхность тела насекомых необходимо стерилизовать. Для наружной стерилизации плодовой (мухи (Drosophila melanogaster), гусениц и куколок тутового шелкопряда (Bombyx mori) применяли 70%-ный этиловый спирт. У бабочек Heliothis zea в стерильных условиях извлекали яичники и стерилизовали их с поверхности 0,5%-ным гипохлоритом натрия, который считается идеальным дезинфицирующим средством в силу его превосходной бактерицидности, стабильности, растворимости, слабой токсичности для млекопитающих, легкости обнаружения (кислый раствор KI—колориметрически) и нейтрализации тиосульфатом). Раствор гиамина (0,1—0,4%) применялся для стерилизации поверхности тела личинок цикадки Agallia constricta и гусениц подгрызающей совки Peridroma saucia. Яйца A. constricta последовательно обрабатывали 75%-ным этанолом и 0,1%-ной HgCl2, а яйца D. melonogaster — сначала 3%-ным гипохлоритом натрия, затем — 0,05%-ной HgCl2 в 70%-ном этаноле. После поверхностной стерилизации необходимо следить, чтобы дезинфицирующее средство не попало в первичную культуру.
Для диссоциации тканей применяли различные средства. Трипсин и версен повреждали покровы Р. saucia. Неповрежденные клетки удалось получить, пользуясь экстрактом гепатоланкреаса улитки Helix aspersa.
Было испытано действие трипсина, версена, гиалуронидазы и экстракта гепатопанкреаса на эпидермис и ткани кишечника и гонад четырех видов бабочек. Трипсин, гиалуронидаза и версен разрушали клетки, если применялись в концентрациях, используемых в культуре тканей позвоночных; но более слабые концентрации были пригодны, и диспергированные клетки образовывали однослойные культуры. Зародышевые ткани D. melanogaster диспергировались в солевом растворе, свободном от Ca и Mg, но содержащем 0,12% версена и 0,15% сырого трипсина. Из зародышей в возрасте до 11 ч получали однородные суспензии отдельных клеток, а из более старых — крупные недиссоцииро-ванные группы клеток. Яичники Heliothis zea распадались под действием 0,25% трипсина в уравновешенном солевом растворе после растирания и встряхивания. Обработка эмбрионов A. constricta 0,25%-ным раствором трипсина не вызывала разделения клеток, но улучшала разрастание клеток от исходных эксплантатов. Видимо, клетки насекомых более чувствительны к действию диссоциирующих агентов, чем клетки позвоночных. Разделение клеток путем измельчения или растирания может быть столь же эффективным, как и обработка ферментами.