Вирус ядерного полиэдроза (NPV)

21.06.2014

Описано около 125 NPV, связанных с четырьмя крупными отрядами насекомых: чешуекрылыми, перепончатокрылыми, двукрылыми и прямокрылыми. Около 90% всех NPV связано с бабочками. Примерно 25% описанных NPV размножали в массе в гусеницах бабочек или в личинках пилильщиков. Для размножения NPV попользовали личинки трех видов пилильщиков: елового общественного пилильщика Gilpinia (Diprion) hercyniae, рыжего соснового пилильщика (Neodiprion sertifer) и пилильщика сосны Банкса N. swainei. Из бабочек для размножения NPV использовали гусениц следующих видов: люцерновой желтушки (Colias philodice eurytheme), коконопрядов Malacosoma fragile, М. neustria; комплекса совок Spodoptera litura, Prodenia eridania, Р. praefica, P. ornithogalli; Spodoptera exigua, S. frugiperda; совок — вредителей хлопчатника, кукурузы и табака — Heliothis zea, Heliothis virescens, капустной совки (Mamestra brassicae), металловидки (Trichoplusia ni), совки-гаммы (Plusia gamma); комплекса форм непарного шелкопряда Lymantria dispar. L. fumida; пихтовой хвоевертки (Choristoneura fumiferana); мешочницы Kotochalia junodi; подгрызающей совки (Peridroma margaritosa); бабочек — Hemerocampa pseudotsugata; Hibernia defoliaria; шелкопряда Dendrolimus spectabilis; яблонной листовертки (Adoxophyes orana (reticulana); боярышницы (Aporia crataegi). Выход NPV колебался от 2 до 50*10в8 PIB (полиэдренных телец-включений) на 1 г личинок пилильщика до 6—43*10в9 PIB на 1 г гусениц (табл. 47). Дополнительные связи NPV с гусеницами указаны у Игноффо.

a. NPV Heliothis: Noctuidae. В ряде статей подробно описан процесс выращивания хозяев, способ заражения их вирусам, биоиспытания, безопасность и полевая эффективность хлопковой совки Heliothis zea. В настоящее время этот вирус подготовлен для регистрации в качестве первого в США промышленного вирусного инсектицида.
Основным хозяином при размножении NPV Heliothis служила Н. zea. В настоящее время для размножения вируса используется та же линия H. zea, что и в 1962 г. С тех пор было выведено свыше 100 поколений, примерно 13 в год. Другие виды Heliothis (H. virescens, H. armigera, H. paradoxa, H. phloxophaga) также были использованы для размножения NPV. Способ, разработанный для выращивания Heliothis (рис. 44), применим для размножения многих NPV. Личинок хлопкового долгоносика выращивали по одной, начиная со стадии яйца или только что отродившихся личинок, на искусственной кормовой среде, в пластмассовых чашках вместимостью 57 мл при 30 °С. В последующих модификациях этого способа для индивидуального выращивания личинок применялись прозрачные полистироловые лотки, разделенные на 50 отделений, вместимостью по 14 мл, герметизируемые нагреваемой пленкой майлар; эти лотки служили как для непрерывной культуры долгоносика, так и для размножения вируса. Выращивать личинок до окукливания было удобнее на лотках с 30 более крупными отделениями (42 мл). Через 6 дней (когда средний вес дичинок достигал примерно 179±12 мг) поверхность среды в каждой чашке опрыскивали 0,2 мл вирусной суспензии в концентрации 1,8*10в7 PIB мл, что равнялось дозе 3,6*10в6 PIB на чашку; ~2500 PIB на 1 мм2 или ~2*10в4 PIB на 1 г личинок. Опрыснутые чашки с личинками инкубировали при 24 °C. После 10-дневной инкубации погибало более 99% личинок, средний вес которых достигал 500—600 мг. При желании можно было через 5—7 дней собирать живых зараженных личинок. Личинок, завороженных для облегчения их сбора вручную, хранили в стаканчиках для мороженого при -20°С.

Полиэдры (тельца-включения) выделяли из больных личинок, очищали и концентрировали путем перемешивания в воде, фильтрования сквозь сито и дифференциального центрифугирования. Вирусы, переработанные в «порошок, высушенный лиофилизацией, или в водные суспензии PIB, хранили до использования в поле при 5 или -20°С. Препараты доводили до стандарта по числу единиц ЛД50, числу PIB и числу вторичных биотипов на 1 мг или 1 мл. За 17 недель на опытной установке, рассчитанной на производство 660 000 гусениц в год, было выращено в общем 215 000 совок (Н. zea 200 000, H. virescens — 15 000). Производством NPV было занято 6 человек, из них четверо на выращивании Heliothis и двое на размножении NPV. Вычисленная стоимость производства гусеницы H. zea составляла 7 центов и гусеницы Heliothis virescens — 2,8 цента. Примерно 60% издержек составляла рабочая сила. Выход вируса составлял в среднем 15*10в9 PIB на гусеницу (3*10в10 PIB на 1 г гусениц) с колебаниями 6—36*10в9 PIB на гусеницу (1,2—7,2*10в10 PIB на 1 г гусениц). Выход PIB превышал расход инокулума более чем в 4000 раз.
б. NPV Trichoplusia: Noctuidae. Бриггс описал способ, который Флуд применял для размножения NPV металловидки, Trichoplusia ni. Гусениц металловидки брали из многочисленных популяций этого вредителя на полевых культурах. Паразитов гусениц и яиц уничтожали, применяя инсектициды избирательного действия. Инокулят распыляли с помощью обычных полевых опрыскивателей и через 4—8 дней собирали больных гусениц вручную. Зараженных гусениц измельчали в воде, фильтровали и быстро замораживали в банках на 0,5 л.
Состав корма, оборудование для выращивания и процедуры, применяемые при размножении NPV металловидки на искусственной среде, описал Игноффо. Как правило, корма и методы были сходны с теми, которые использовались при размножении NPV Heliothis. После 6—7-дневного выдерживания при 30°C на искусственной среде этот субстрат опрыскивали 0,2 мл суспензии, содержавшей 5*10в6 PIB на 1 мл. Это было равно дозе около 1*10в5 PIB на 1 гусеницу или ~5*10в5 PIB на 1 г гусениц (210 мг на 1 гусеницу). Гусениц содержали на корме, обработанном вирусом, в сосудах с крышками, вместимостью 225 мл при 23 °С. Больных личинок собирали через 4—5 дней и хранили при —20°С. Суспензии (8*10в9 PIB на 1 мл), хранившиеся в замороженном виде в воде при -20 °С, сохраняли жизнеспособность не менее 15—18 месяцев. Методика отделения PIB была идентична описанной для NPV Heliothis.
При расчетном годовом объеме производства в 168 000 гусениц два работника за 6-недельный опытный период получили 20 520 гусениц (2904 сосуда емкостью 225 мл). Выход составлял в среднем 13*10в9 PIB на гусеницу (43*10в9 PIB на 1 г гусениц); вычисления показали, что количество PIB увеличилось в 10в4 раза но сравнению с их количеством, затраченным для инокуляции. Выращивая гусениц на капустных листьях, Мак-Ивен и Харви получали 8*0в9 PIB на гусеницу или 26*10в9 PIB на 1 г личинок. Больные гусеницы, собранные в поле, содержали в среднем 6*10в9 PIB на гусеницу или 20*10в9 PIB на 1 г гусениц.
в. NPV Adoxophyes: Tortricidae. Понсен использовал гусениц капустной совки, Mamestra brassicae, как замену основного хозяина для размножения NPV и CPV яблонной листовертки, Adoxophyes оrаnа, поскольку более ранние исследования показали, что гусеницы этого вида восприимчивы к вирусам. Гусеницы капустной совки использовались потому, что были крупнее, их легче выращивать и имелась несколько измененная искусственная кормовая среда Адкиссона. Отродившихся гусениц в течение первых трех дней кормили капустными листьями, а затем переводили на искусственный корм, обработанный NPV. Выход достигал 4*10в9 PIB на гусеницу или около 16*10в9 PIB на 1 г гусениц. Стоимость производства при использовании в качестве хозяина А. огапа составляла 0,5 цента на гусеницу при производстве в лаборатории примерно 11*10в3 гусениц в год.
г. NPV Lymantria (Porthetria): Lymantriidae. Льюис размножал NPV непарного шелкопряда, используя для этого лабораторную линию шелкопряда, выращенную на искусственной среде. Тот же корм и сходная методика применялись и при размножении NPV коконопряда. Вначале для размножения вируса использовали гусениц, собранных в природе. Гусениц 4-го возраста (со средним весом 69 мг) кормили группами по 10—1000 особей на пучках листьев или на поверхности кормовой среды, опрыснутой вирусом из расчета 10в5—10в7 PIB на гусеницу или 10в6—10в8 PIB на 1 г гусениц. Выращивание и инкубация велись при 25 °С. Метод отделения PIB описали Роллинсон и Льюис. Через 12—20 дней мертвых и больных гусениц собирали, растирали в воде, пропускали через частое пластмассовое сито и дифференциально центрифугировали (750, 2000 и 5000 об/мин), чтобы сконцентрировать PIB. В готовых суспензиях подсчитывали количество PIB и хранили их в буферных растворах (pH 7) при 4 °С. Если намечалось длительное хранение, PIB предварительно лиофилизировали, подвергали мгновенному выпариванию или воздушной сушке. Выход достигал 1—2,510в9 PIB на гусеницу, или около-10в10 PIB на 1 г гусениц, что составляло увеличение в 10в2—10в4 раза по сравнению с расходом инокулума. Достигнутая годовая производительность лабораторной установки составила 1 млн. больных гусениц (~10в15 PIB в год). Baгo и Атжер получили 30 г «чистых» PIB (~3*10в13 PIB или — 12,5—30,0*10в3 больных гусениц), применяя дозу 1—3*10в3 PIB на взрослую гусеницу. Отделение PIB проводили из куколок.
д. NPV Neodiprion: Diprionidae. Смирнов использовал для выращивания в помещениях собранных в природе личинок пилильщика сосны Банкса, Neodiprion swainei, большие дощатые стеллажи (275х91х30 см), а на открытом воздухе — вращавшийся круг. Три миллиона личинок 2-го возраста, размещенные на 35 стеллажах, выкармливались при 25—30°C на сосновой хвое, опрыснутой вирусом из расчета 5—25*10в7 PIB на стеллаж (50 мл/стеллаж, 1—5*10в5 PIB/мл). На «карусели» вне помещения обрабатывали одновременно 5*10в5 личинок. Доза инокулума составляла 3—18*10в3 PIB на личинку, или 1—6*10в5 PIB на 1 г личинок. В течение первых трех дней личинки 2 раза в день получали свежую хвою, опрыснутую вирусом, а в остальные 10—18 дней — свежую необработанную хвою.
В течение 2—3 недель инкубации больных, мертвых и гибнущих личинок собирали к хранили при 4°С. Концентраты полиэдров получали путем центрифугирования после растирания в воде и фильтрования сквозь марлю и нейлон. Суспензии PIB хранили в полиэтиленовых контейнерах при 4 °С. Из 3 млн. личинок было получено в среднем 10в7 PIB на личинку или 2*10в8 PIB на 1 г личинок. Из 10в5 личинок получилось в среднем 6—13 и 10в6 PIB на личинку. Выход в 3—4*10в3 раз превышал расход инокулума. Стоимость производства, включая заработную плату и необходимые материалы, но без накладных расходов, составила 0,04—0,09 цента на личинку, исходя из среднего выхода 10в7 PIB на личинку. PIB хранили в высушенном виде или в разведенных суспензиях. Короткое время (полиэдры можно хранить в бензоле или в нефти.
NPV рыжего соснового пилильщика (N. sertifer) размножали также в личинках 3—4-го возраста, собранных в природе. Личинок на хвое смолистой сосны опрыскивали, расходуя 4 мл суспензии 10в6 РIВ/мл (2—4*10в3 PIB на 1 личинку =7,13*10в4 PIB на 1 г личинок) на 1000—2000 особей. Обработанных личинок и хвою помещали в вентилируемые картонные коробки (по 1000—2000 личинок на коробку) и содержали в инсектарии вне помещения при температуре около 21°C. Больных личинок собирали вручную и перерабатывали по методу Льюиса.
Средний выход 10в8 PIB на личинку или 25*10в8 PIB на 1 г личинок примерно в 10в4 раза превышал расход инокулума. За 3 весенних месяца производительность достигала 1—2 млн. личинок при стоимости одной личинки 1—2 цента.