01.09.2017
31.08.2017
08.08.2017
14.07.2017
06.07.2017
19.06.2017
19.06.2017
19.06.2017
15.06.2017
12.06.2017
Разведение бактерий в живых организмах
 21.06.2014

Для разведения бактерий применяют обычно ферментацию, и только когда это неосуществимо, прибегают к живым системам. Из 90 видов бактерий, выделенных и описанных из насекомых, только четыре разводились в живых хозяевах. Все четыре относятся к спорообразующим Bacillus или Clostridium, указанным в таблице 44. Виды Bacillus аэробны или факультативно анаэробны, а виды Clostridium анаэробны или хотя бы переносят аэробные условия.
Датки использовал личинок японского жука (Popillia japonica) для разведения Bacillus popilliae и В. lentimorbus, а Бухер — гусениц коконопряда, Malacosoma ssp. для разведения Clostridium brevifaciens и С. malacosomae. Выход продукции колебался от 1 до 49*10в8 спор на 1 г хозяев. Именно эти первые опыты Датки с бактерией—возбудителем молочной болезни показали, что можно разработать технологию производства, успешно используемую при разведении облигатного патогена насекомых. Препараты изготовленные по способу Датки, все еще имеются в продаже для борьбы с японским жуком под фирменными названиями Дум и Джепидемик.

Виды Clostridium

Для разведения в лаборатории С. brevifaciens и С. molacosomae в качестве бактериальных инсектицидов Бухер использовал собранных в поле гусениц кольчатого коконопряда Malacosoma ameriсаnum. Можно было использовать и два других вида — М. pluviale и М. disstria, но Бухер предпочел М. americanum потому, что собранные в природе гусеницы были относительно свободны от вируса и, кроме того, для этого вида неизвестны случаи естественного заражения Clostridia. Из числа хозяев к Clostridium восприимчивы только виды Malacosoma. Для разведения С. brevifaciens или С. malacosomae в М. americanum Бухер применял следующий метод. Гусениц, собранных с пологов под естественно зараженными деревьями и разделенных по величине на партии по 20—25 особей, помещали в полулитровые коробочки от мороженого или в пластмассовые ящички емкостью 1,14 л. Гусеницам 4-го возраста скармливали пучки листьев (черемухи, яблони или других розоцветных), предварительно погруженные в суспензию, содержавшую 10в3—10в4 спор/мл. Листья ежедневно заменяли свежими. После 6—10 дней инкубации при 20—26 °C все гусеницы погибали.
После гибели гусениц собирали все содержимое инкубационных контейнеров. Споры отделяли уже в течение болезни, но большая часть их выделялась в экскрементах во время поноса, поражавшего гусениц незадолго до гибели. Части растений, мертвых гусениц и остатки корма отмывали раздельно, слегка покачивая, чтобы освободить споры. После повторной промывки надосадочные жидкости объединяли, пропускали через марлю и центрифугировали при 2000 об/мин. Осадок, состоящий из спор и частиц, доводили в воде до стандарта (по числу спор/мл) и хранили при 4—6 °С; в этих условиях споры сохраняли жизнеспособность несколько лет. В лаборатории при постоянном наличии живого материала описанным методом можно было получать до 2—4 млн. больных гусениц в год. Максимальный выход продукции, достигнутый Бухером, составил 2*10в7 спор на гусеницу, или около 10в8 спор на 1 г гусениц. Выход спор в 50 000 раз превышал расход инокулята.
Виды Bacillus

Хотя основным хозяином для разведения В. popilliae служили личинки японского жука, однако не менее 50 других видов Scarabaeidae также восприимчивы к этому патогену. Других возбудителей молочной болезни, В. lentimorbus и В. euloomarachae, также можно размножать в личинках пластинчатоусых жуков.
Описанный здесь способ и технология размножения В. popilliae в Popillia japonica представляют собой квинтэссенцию исследований Датки, Уайта и Датки и Уайта и Мак-Кейба. Взрослым личинкам (весом около 225 кг), собранным в естественно зараженной почве, инъецировали каждой по 10в6 спор в 30 мкл (4,4*10в6 спор на 1 г личинок). Использовались предпочтительно взрослые личинки, хотя для данной цели пригодны и более молодые — 2-го и 3-го возраста. Каждую инъецированную личинку помещали в отдельную дюймовую ячейку разгороженного ящика и засыпали почвой, содержавшей 227—453 г смеси семян трав (клевер ползучий : полевица белая = 1 : 1) на 45,6 кг почвы. Влажность почвы доводили до 60% ее полевой влагоемкости. Прорастающие семена служили пищей во время инкубации. Для размножения патогена личинок использовали партиями по 500 на инкубационный ящик, куда их закладывали в 5 слоев, по 100 личинок в каждом, и в течение 10—12 дней выдерживали при 30 °С.
После инкубации больных личинок выбирали из почвы, просевая ее через сито, помещали в ледяную баню и отмывали их от приставшей земли. Ледяная вода предотвращала каннибализм и уменьшала потерю спор. Собранных личинок закладывали в лед и хранили при 0—2 °С, пока не набиралось количество, достаточное для дальнейшей переработки. Больных личинок пропускали через мясорубку, получая таким образом суспензию спор и тканей личинок. Суспензию, доведенную до стандарта по числу спор в 1 мл, смешивали с осажденным карбонатом кальция. Для получения сухого, тонкого, концентрированного дуста с содержанием 10в9 спор/г применяли центробежный вентилятор с подогревом воздуха. При запланированной производительности установки 0,5—5 млн. больных личинок в год был достигнут средний выход 1,1*10в9 спор на 1 личинку (0,4—1,6*10в9). Средний минимальный выход (в условиях голодания) составлял 2*10в9 спор на 1 г личинок по сравнению со средним максимальным выходом 7,1*10в9 спор на 1 г личинок. Выход спор по сравнению с количеством, использованным для инокуляции личинок, увеличился в среднем примерно в 1100 раз. Розничная цена препаратов Дум и Джепидемик составляла 1,3—1,4 цента за 1 г, откуда стоимость одной личинки определяется примерно в 15 центов.