07.11.2017
31.10.2017
21.10.2017
21.10.2017
21.10.2017
04.10.2017
04.10.2017
28.09.2017
01.09.2017
31.08.2017
Разведение энтомопатогенных простейших в живых организмах
 21.06.2014

Из примерно 210 видов простейших только около двух дюжин размножали в живых системах для возможного использования в качестве микробиологических инсектицидов. За исключением одного вида, все они относятся к классам Telosporea и Microsporidea. Большинство относится к микроспоридиям из сем. Nosematidae. Виды из порядков Eucoccida и Haplosporida представляют собой потенциальные микробиологические инсектициды, пригодные для борьбы с вредителями запасов, пастбищ и короедами; однако фактически ни один из них еще не размножали для этой цели. Хозяевами для массового разведения патогенных простейших служат бабочки, прямокрылые, жесткокрылые, перепончатокрылые. Дополнительные сведения о простейших, связанных с насекомыми, содержатся в работах Вейзера и Липы. Тейлор и Кинг и Вейзер (личное сообщение) использовали для разведения видов Endamoebidae или Nosematidae саранчовых (Melanoplus, Locusta) или тараканов. Циммак и др., Вейзер, Мак-Лафлин и Белл и Смирнов использовали гусениц (Antheraea, Aporia, Cydla (carpocapsa), Crambus, Ephestla, Euproctis, Hyphantrla, Lymantrla, Malacosoma, Ostrinia, Plerls, Plodia, Tineola), жуков (Anthonomus, Otiorrhynchus, Phyllotreta, Pityocteines, Scolytus, Tribolium) или пилильщика Pristiphora для разведения видов Schizocystidae или Nosematidae. Двукрылых (Culex, Anopheles, Culiseta) также использовали для разведения видов Nosematidae. Выход простейших колебался от 3000 до 4600*10в6 спор на 1 г веса хозяев.

Rhizopoda: entamoebidae

Еще в 1936 г. Тейлор и Кинг размножили Malamoeba (Malpighamoeba) locustae в саранчовых. Хотя в основном для этой цели использовали Melanoplus differentiates, однако М. mexicanus, М. femurribrum и 37 других видов Acrididae также были восприимчивы к этому патогену.
По методу, которым Тейлор и Кинг пользовались для разведения М. locustae, естественно зараженных самцов и самок М. differentialis содержали в садках раздельно и кормили листьями растений. Экскременты, содержавшие цисты Malamoeba, собирали через каждые 24 ч и растирали в 500 мл воды. Крупные частицы удаляли, пропуская суспензию через сито. Число цист на 1 мл суспензии доводили до стандарта. За двухдневный цикл производства средний выход составлял 3*10в6 цист на самку и 2*10в6 цист на самца, или в среднем примерно 3,8*10в6 цист на 1 г саранчовых в день.
Telosporidia: schizocystidae; nosematidae

а. Размножение Mattesia и Glugea. Мак-Лафлин и Белл разводили два вида споровиков — Mattesia grandis и Glugea gasti в личинках хлопкового долгоносика. Взрослых жуков, несмотря на их восприимчивость, они не использовали, так как разводить личинок было проще и дешевле. Можно было использовать также других хозяев. Mattesia заражает широкий круг насекомых — 12 видов бабочек, 3 — жуков, 1 — Siphonaptera, 1 — перепончатокрылых. Поскольку металловидка (Trichoplusia ni), совки (Heliothis zea, H. virescens) и хлопковая моль (Peetinophora gossypiella) тоже восприимчивы и пригодны для массового разведения, их можно считать потенциально пригодными хозяевами для разведения Mattesia.
Мак-Лафлин и Белл успешно применили для получения спор М. grandis и G. gasti следующий способ, основанный на опыте выращивания и кормления хлопкового долгоносика, Вандерцанта и Девича, Ирла и др. и Гаста и Девича. Яйца хлопкового долгоносика помещали в полусинтетическую твердую агаровую питательную среду в чашке Петри и выдерживали при 30 °C и 50—60%-ной относительной влажности. Гаст и Девич нашли, что такая влажность необходима, чтобы свести до минимума загрязнение среды микробами и предотвратить высыхание корма. Из 100—150 яиц они получали от 40 до 90 взрослых долгоносиков на чашку. Через 2—4 (т. е. во 2-м возрасте) или 4—6 дней (в 3-м возрасте) после отрождения личинок и среду опрыскивали водной суспензией спор G. gasti или М. grandis. Пользуясь храмографическим распылителем, они расходовали на каждую чашку 1 мл суспензии с концентрацией 10в6 спор/мл или около 150 спор/мм2 поверхности среды. Обработанные чашки выдерживали при 30 °C, пока из куколок не выходили долгоносики, что происходило через 10—13 или 6—10 дней после обработки соответственно спорами G. gasti или М. grandis. Жуков помещали в садки и в течение 2—4 (G. gasti) или 5—6 дней (М. grandis) скармливали им споры, чтобы обеспечить дальнейшее развитие заражения простейшими и создать оптимальные условия для споруляции.
Зараженных долгоносиков, в большинстве уже мертвых, растирали в воде, чтобы высвободить споры из зараженной ткани. Затем суспензии опор с остатками жуков фильтровали через сложенную вчетверо марлю, подвергали дифференциальному центрифугированию, фильтровали, отмывали и снова центрифугировали, чтобы сконцентрировать споры. До использования в полевых опытах споры хранили при 4 °C в воде, но не дольше двух недель (G. gasti) или двух месяцев (М. grandis). Более длительное хранение соответственно снижало жизнеспособность спор, т. е. процент заражения долгоносиков.
После нескольких месяцев производства выход спор G. gasti и М. grandis составлял в среднем соответственно 68*10в6 и 17*10в5 спop на 1 жука. Максимальный выход достигал 25*10в7 спор G. gasti и 410в6 спор М. grandis на личинку. Средний выход из расчета на одного долгоносика весом 15 мг составлял 46*10в8 спор G. gasti и 10в8 спор М. grandis на 1 г долгоносиков. Принимая выход долгоносиков на чашку равным 1 г (в среднем 67 долгоносиков на чашку), увеличение продукции по сравнению с количеством инокулята составило соответственно 100 и 5000 раз для М. grandis и G. gasti. Стоимость получения 1000 зараженных долгоносиков без накладных расходов составила 3 долл. 42 цента.
б. Разведение Thelohania и Nosema spp. Вейзер разводил 13 видов Nosema, четыре вида Thelohania и два вида Plistophora в преимагинальных двукрылых, жесткокрылых, прямокрылых или чешуекрылых, выращенных в лаборатории и в инсектарии или собранных в природе. При разведении Thelohania hyphantriae хозяином служили в основном гусеницы Hyphantria сunеа, но были использованы также Euproctis chrysorrhoea и Malacosoma neustria. Nosema lymantriae, N. serbica и N. muscularis размножали в гусеницах непарного шелкопряда.
Гусениц для разведения Thelohania или Nosema выращивали до 2—4-го возрастов на листьях шелковицы, дуба или ивы. Выбранные деревья и (или) кладки яиц или гусениц в садках на листьях опрыскивали суспензией в концентрации 1—5*10в5 спор/мл.
Гусениц выращивали партиями по 500—1000 особей в каждой. Примерно через 10—20 дней, в зависимости от вида Protozoa и условий окружающей среды, больных гусениц и (или) куколок собирали и хранили на холоде для дальнейшей переработки. Собранных гусениц растирали в воде, споры очищали и концентрировали путем дифференциального осаждения или центрифугирования. При хранении в воде с добавлением антибиотиков или без них при 4—8 °С споры сохраняли жизнеспособность не менее 12 месяцев. Средний выход спор Т. hyphantriae или N. lymantriae составлял соответственно 10в7 или 3—5*10в7 опор на гусеницу. В среднем выход спор Thelohania и Nosema по сравнению с затраченными на инокуляцию был соответственно в 1000 и 5000 раз больше.
Для разведения Nosema infesta Холл использовал сначала гусениц огневки Crambus bonifatelius. Когда при разведении огневки возникали затруднения, Холл попробовал использовать гусениц Junonia coenia и в конце концов остановился на картофельной моли, Gnorimoschema operculella. Финни и др. разработали метод массового разведения картофельной моли, который Холл успользовал с небольшими изменениями для разведения N. infesta. Клубни величиной с куриное яйцо окунали в суспензию спор Nosema (5*10в6 спор/мл), заражали их только что отродившимися гусеницами моли и выдерживали затем при 28 °C до конца развития гусениц картофельной моли. Через 10 дней выросших зараженных гусениц собирали и растирали в воде для отделения спор Nosema; полученные суспензии фильтровали через марлю, доводили до стандарта по численности спор на 1 мл и хранили при 5° или —30 °С, При 5 °C споры теряли инфекционность через 6—12 месяцев, но при —30 °C сохраняли ее и после 12 месяцев хранения.
Холл не приводит данных о выходе спор, но если принять средний выход равным 1*10в7 спор на гусеницу, а вес гусеницы равным 25 мг, то, вероятно, выход достигал в среднем 4*10в8 спор на 1 г гусениц. При повторном проведении через гусениц картофельной моли выход спор неизменно снижался, и в конце концов разведение прекращали, поскольку выход становился меньше затраченного инокулума. Выход спор, вычисленный на основе средней численности 50 гусениц на клубень, увеличивался по сравнению с количеством инокулума примерно в 100 раз. Стоимость разведения хозяина составляла меньше 1 долл. на 1000 гусениц картофельной моли.