Разведение грибов в целых организмах

21.06.2014

Большинство энтомопатогенных грибов не относится к облигатным патогенам. Из более чем 500 испытанных видов в живых хозяевах для последующего использования в борьбе с насекомыми размножалось меньше 2% (табл 43). Для производства большинства их применяли метод поверхностной или глубинной ферментации.

Были использованы многие виды Moniliaceae, несколько видов Zythiaceae и Entomophthoraceae, но не Coelomomycetaceae. Методы разведения, сходные с описанными для других облигатных патогенов, никогда не были полностью разработаны или применены к облигатным грибным патогенам (табл. 44). Подробные данные о разведении хозяев, инокуляции, инкубации, отделении конечного продукта, его выходе и т. д. в большинстве случаев отсутствуют. Имеющаяся информация относится обычно к периоду до 1940 г. Инсектицидное использование тех облигатных грибных патогенов, которых размножали, проводилось путем интродукции или внесения с мертвыми или живыми зараженными насекомыми. С небольшими изменениями этот метод успешно использовался в борьбе с люцерновой тлей Therioaphis maculata при помощи Entomophthora exitialis, E. virulenta, E. coronata; в борьбе с зеленым яблонным клопом применялась E. erupta; с гусеницами златогузки — E. aulicae; с комарами — Coelomomyces stegomyiae; с яблонной медяницей — Е. sphaerosperma; с кобылками — E. grylli; с клопом-щитником — Beauveria bassiana; с беложрылками — Aschersonia aleyrodis; с гусеницами бабочки из сем, Zygaenidae — В. bassiana не картофельной тлей — Acrostalagmus aphidum. Обширный обзор и других связей насекомых с грибами составил Мюллер-Кёглер.

Blastocladiales

Полевые опыты показали, что грибы из порядка Blastocladiales, например Coelomomyces spp., могут стать перспективным, «микробиологическим инсектицидом». Лэйрд показал, что Coelomomyces можно было бы акклиматизировать в новых районах и повысить частоту их встречаемости в тех районах, где они уже имеются. Однако способы их разведения на искусственных средах или в живых хозяевах еще не разработаны. Опыты по передаче болезни в лабораторных условиях (необходимая предпосылка, чтобы считать облигатного патогена микробиологическим инсектицидом), за одним-двумя исключениями, обычно были безуспешными. После нескольких неудач Лэйрд сумел заразить личинок Aedes aegypti, используя спорангии С. stegomyiae, собранные на A. albopictus. В качестве инокулума использовались больные личинки, их остатки и придонный осадок водоема, где обитали личинки, пораженные Coelomomyces, а также фильтровальная бумага с высушенными остатками больных личинок. В лаборатории заражение происходило после того, как личинки в течение 13—24 дней соприкасались с инокулумом, помещенным в дистиллированную воду, забуференную при pH 6,6. Развитие зараженных личинок сильно отставало. Коуч добился непрерывного заражения в лабораторных условиях малярийного комара Anopheles quadrimaculatus в течение почти двух лет. Выход патогена составлял обычно 2—5*10в3 спорангиев на личинку комара (2—5*10в6 спорангиев на 1 г личинок) при максимуме 63 000 спорангиев на личинку или 6,3*10в7 спорангиев на 1 г личинок. Принимая, что спорангий содержит в среднем 100 зооспор, максимум в 6,3*10в6 зооспор на личинку или 6,3*10в9 зооспор на 1 г личинок можно считать вполне возможным (табл. 45).

Водное местообитание Coelomomyces Spp., его естественная стойкость и восприимчивость к нему водных вредных насекомых, которых обычно трудно уничтожать с помощью патогенов, делает этот гриб очень привлекательным в качестве микробиологического инсектицида. К Coelomomyces восприимчивы виды двух семейств водных двукрылых — мошек (Simuliidae) и комаров (Culicidae), причиняющие серьезные неприятности человеку, и один вид гладыша, Notonecta sp. (Hemiptera; Notonectidae). Окончательное решение о пригодности Coelomomyces в качестве микробиологического инсектицида будет принято лишь после того, как накопится больше данных. Исследованию в первую очередь подлежат факторы, влияющие на заражение восприимчивых или потенциально восприимчивых хозяев, пригодных для массового размножения.

Entomophthorales

Еще в 1912 г. Спир и Колли описывали разведение Entomophthora aulicae в собранных в природе гусеницах златогузки Nygmia phaeorrhoea. В течение четырех лет (1908—1911 включительно) этот способ успешно применялся для получения 10в3 больных гусениц за сезон. Размножение японского вида Entomophthora на гусеницах непарного шелкопряда дало менее обнадеживающие результаты. Ниже приводится обзор методики разведения, описанной Спиром и Колли. Основным хозяином служили молодые гусеницы златогузки, но в качестве замены можно было использовать гусениц по меньшей мере 16 других видов бабочек. Гнезда с гусеницами собирали в местах естественного заражения и до использования хранили при 2—3°С. Разведение начинали за 1—2 месяца до намеченного весеннего или осеннего использования гриба. Для выращивания и заражения гусениц применяли отдельные деревянные ящики (27,5х67,5х67,5 см). Дно ящика засыпали тонким слоем почвы или крупного песка, а отверстие в крышке обмазывали изнутри гусеничным клеем. В каждый ящик помещали примерно по 200 гнезд с гусеницами, которых кормили листьями малины, дуба, ивы или вишни. Зимой и ранней весной для кормления использовали листья тепличной малины или салата. Выращивание гусениц велось при 27°С. Инокулумом служили живые заболевшие гусеницы, которых подсаживали в ящики к здоровым. В периоды года, когда гусениц хозяина в природе не имелось, жизнеспособность инокулума поддерживали путем серийных пассажей, используя гусениц, хранившихся при низкой температуре. Чтобы обеспечить образование спор и заражение хозяев, в ящиках для заражения поддерживали повышенную влажность. Во внесенных больных особях образовывалось столько спор, что их хватало для заражения 50—85% гусениц в течение 10 дней. Мертвых и гибнущих гусениц ежедневно вынимали из ящиков и заменяли здоровыми. Это повторялось до тех лор, пока не набирали требуемое количество больных особей. Выход достигал «сотен тысяч» спор на одну полновозрастную гусеницу. Расчеты показали, что годовая производительность достигала 2*10в11 спор (2*10в5 гусениц в год и 10в6 спор на гусеницу).
Дастан также применял интродукцию болезни для разведения Е. sphaerosperma или E. erupta соответственно на яблонной медянице, Psylla mali и яблонном клопе Lygus communis. В качестве инокулума он использовал покоящиеся споры Eniomophthora. Испытав различные способы заражения, Дастан решил, что для разведения и использования Entomophthora лучше всего применять перенос листьев с находящимися на них больными насекомыми и пойманных взрослых больных насекомых или же использовать зараженные деревца из питомников.
Инокулум, состоящий из покоящихся спор, хранившихся в течение зимы в почвенных садках, помещали в небольшие садки, где были сеянцы яблонь, зараженные Р. mali или L. communis. Первоначально инокулум размножали в маленьких садках, затем переносили его в более крупные (высотой 6 м), сооружаемые вокруг яблонь. Высокую влажность поддерживали путем частых поливов и опрыскиваний. Из этих садков больных насекомых затем интродуцировали в плодовые насаждения.

Sphaeropsidales

Берджер использовал цитрусовые для «размножения» красной ашерсонии (Aschersonia aleyrodis) на белокрылках, Dialeurodes citri и D. citrifolil. От способа, описанного выше, он отказался после того, как Фосетт добился успеха в разведении Aschersonia spp. на искусственных средах. Для размножения A. aleyrodis в природных популяциях белокрылок Берджер применил следующий метод. Листья цитрусовых, несущие пустулы со спорами и мицелий A. aleyrodis, тщательно прополаскивали в воде, которую затем фильтровали через марлю. В качестве инокулума для разведения патогена, а также для борьбы с белокрылками в природе использовали примерно 80 пустул на 1 л воды. Это составляет до 10в4—10в5 спор/мл, если принять, что круглая пустула (диаметром 1000 мк) заполнена спорами (диаметром 20—30 мк), или 0,4—4*10в9 спор на взрослое апельсиновое дерево. Начало заражения популяций белокрылки было отмечено через 10 дней, а максимума оно достигло через 3 недели. Споры гриба «образовывались в огромных количествах в виде красных возвышений или пустул», выступавших на теле мертвых личинок. Расчеты показали, что выход спор по сравнению с количеством инокулума, использованным для вышеописанной процедуры (из расчета 17*104 листьев на взрослое апельсиновое дерево; 1 пустула на лист; 10в6 спор на пустулу; при количестве инокулума 4*10в8 спор на дерево), увеличился меньше чем в 500 раз. В свете современных данных вопрос о значении Asсhersonia spp, как потенциального микробиологического инсектицида следует пересмотреть, поскольку разработан методы ее разведения на искусственных средах.