07.11.2017
31.10.2017
21.10.2017
21.10.2017
21.10.2017
04.10.2017
04.10.2017
28.09.2017
01.09.2017
31.08.2017
Вегетативный рост Bacillus popilliae
 21.06.2014

Поскольку каждая клетка-прародительница образует только одну спору, необходимо создавать условия для максимальной продукции вегетативных клеток при ферментации. При оптимальных условиях за 16—18-часовой период роста в аэрируемых ферментерах получают около 2*10в9/мл жизнеспособных вегетативных клеток В. popilliae. Характер роста показан на рисунке 43. В колбах на качалках получают несколько меньшие популяции.
Для углеводного обмена и для максимального роста В. popilliae требуется кислород. Хотя вегетативный рост происходит при пониженном парциальном давлении кислорода, а в адаптированных культурах, возможно, и в анаэробных условиях, выход клеток бывает меньшим. Гемолимфа личинок содержит растворенный кислород, количество которого во время роста патогена уменьшается примерно до половины его содержания у нормальных или у зараженных личинок, содержащих преимущественно споры.

Вегетативный рост Bacillus popilliae

Для роста В. popilliae на синтетической среде требуются как минимум 11 аминокислот, тиамин и барбитурат. Ho на синтетических средах рост сильно ограничен и серийный пересев часто не удается. Наибольший выход клеток получают при средах, содержащих сложные источники азота. В. popilliae, видимо, требует неизвестных регуляторов роста или такого баланса питательных веществ, который наилучшим образом обеспечивается специальными дрожжевыми экстрактами. Стандартная культуральная среда (обозначаемая MD) содержит 1,5% дрожжевого экстракта, 0,3% К2НРО4 и 0,2% глюкозы (все компоненты автоклавируются раздельно и добавляются в стерильных условиях); часть дрожжевого экстракта можно заменить другими источниками органического азота, например ферментативным гидролизатом казеина. Иногда в среду MD включают триптон, поскольку он повышает жизнеспособность, и среды, простерилизованные фильтрацией, обеспечивают значительно лучший рост. Периоды кипячения, необходимые для тепловой стерилизации больших объемов, делают среды непригодными для роста бактерий и требуется стерилизация фильтрованием. Хотя на менее дорогих средах, приготовленных на кукурузном экстракте или некоторых других источниках азота, рост бактерий соответствует росту на среде MD, однако при серийных пересевах эти среды не поддерживают роста патогена. В промышленных условиях инокулум можно готовить на среде MD, а производство биопрепарата вести на заменяющей среде.
За логарифмической фазой роста бактерий обычно следует стационарная фаза, в течение которой число клеток мало изменяется. Стационарная фаза может длиться часами, прежде чем заметно снизится жизнеспособность, особенно если происходит нейтрализация вредных продуктов, образующихся в логарифмической фазе роста. У споровых бактерий спорообразование происходит сразу после логарифмической фазы. Однако в культурах В. popilliae клетки отмирают, не образуя спор. Как правило, через 24 ч после достижения максимальной численности бактерий в культуре остается в живых меньше 0,1% клеток (рис. 43). Культуры, в которых численность бактерий не достигает максимальной, выживают соответственно дольше. Таким образом, долговечность культуры можно увеличить, изменяя условия, ведущие к ограничению роста (субоптимальная температура, минимальные количества инокулума, ограничение питательных веществ или меньшее поступление кислорода). Жизнеспособность культуры можно продлить также включением частиц углерода в среду или диализом во время роста. Ho способы культивирования могут в лучшем случае ограниченно повышать выживание. Хотя клетки и не распадаются при длительной инкубации, но среди выживших появляются причудливые формы. Остаточная жизнеспособность не является результатом споруляции какой-либо части популяции или появления необычно устойчивых клеток; культуры, выделенные из выживших клеток, ведут себя так же, как и исходные. Kocтилов и др. полагали, что причиной гибели клеток является накопление перекиси водорода. Родс высказал предположение, что гибель клеток наступает вследствие того, что они вынуждены образовывать споры, что они в существующих условиях неспособны осуществить. Независимо от причины быстрая гибель культур — это, по-видимому, симптом, а не причина аспорогении.
Вегетативные клетки из культур в колбах или небольших ферментерах вызывают при инъекциях заражение личинок японского жука, и в ходе болезни опоры образуются нормально. Число вегетативных клеток, требующееся, чтобы вызвать заболевание, колеблется в зависимости от их физиологического состояния. Оптимальное число клеток, взятых в логарифмической фазе, составляет около 10в3 на личинку. Большие дозы нужны, если клетки берут в фазе снижения кривой роста или при росте в плохих условиях. Маловероятно, что в период размножения патогена в личинке каким-то образом повторно отбираются спорулирующие штаммы и что аспорогенные варианты неизменно отбираются при росте на лабораторных средах. «Молочная болезнь» была вызвана у личинок путем инъекции вегетативных клеток штамма, отличавшегося исключительным свойством, тот же штамм был выделен впоследствии из спор, образовавшихся в зараженном насекомом.
Инъекция чрезмерных количеств вегетативных клеток вызывает слишком сильное заражение, убивающее личинок раньше, чем в них образуются споры. Возможно, что для метаболической активности большого числа вегетативных клеток баланс питательных веществ в гемолимфе недостаточен или же что во время роста и гибели инвазионных клеток освобождаются токсические количества чуждого клеточного материала. Мы установили, что инъекция больших количеств мертвых вегетативных клеток оказывает летальное действие, а Датки, утверждал, что В. popilliae при выращивании на искусственной среде вырабатывает токсическое вещество. Следовательно, при обильном заражении гемолимфы гибель может быть вызвана образованием токсина in vivo.