04.10.2017
04.10.2017
28.09.2017
01.09.2017
31.08.2017
08.08.2017
14.07.2017
06.07.2017
19.06.2017
19.06.2017
Глубинная ферментация Bacillus thuringiensis
 21.06.2014

Игноффо представил схему процесса ферментации, используемого фирмой International Mineral and Chemical Corporation (IMC), для производства жидких препаратов спор и токсинов ВТ. Слегка измененный вариант этой схемы показан на рисунке 42. Игноффо не указывал состав сред и метод ферментации, но предполагается, что ферментация основывалась на патенте Мегны и протекала следующим образом: инокулум для промышленного ферментера готовили, проводя ВТ через две среды в колбах на качалках и ферментер для инокулята. В первой колбе использовали питательный бульон, а во второй и в ферментере для инокулята — среду, состоящую из 1 % свекловичной мелиссы, 0,85% сухого вещества кукурузного экстракта и 0,1% CaCO3. В каждой из колб на качалках культуру выдерживали по 24 ч. В ферментере для инокулята ее оставляли до начала обильного вегетативного роста, после чего использовали для инокуляции среды в промышленном ферментере. В этом ферментере состав среды мог колебаться, но содержание сухого вещества не должно было превышать 3—4%, а содержание сбраживаемых углеводов и азота, имеющееся для роста патогена в данной среде, исчерпывалось примерно одновременно после начала споруляции. Типичная среда содержала 1,86% свекловичной меляссы, 1,4% муки из семян хлопчатника (Pharrnamedia), 1,7% сухого вещества кукурузного экстракта и 0,1% СаСО3. После окончания споруляции питательную среду пропускали через мелкое сито для отделения крупных частиц, центрифугировали, разбавляли различными стабилизаторами и разливали в тару. В патенте Мегны было указано, что конечный продукт обладал инсектицидной активностью, а жидкая ферментированная среда в конце процесса содержала 2—5*10в9 жизнеспособных спор на 1 мл. Ho как велика была инсектицидная активность при такой ферментации, указано не было.

Глубинная ферментация Bacillus thuringiensis

В своем патенте Мегна описал процесс отделения, основанный на фильтровании ферментационной жидкости с помощью слоя мелкозернистого материала, например Целита-512, Он утверждал, что любая неуравновешенность содержания азота и углеводов вызовет неполную споруляцию, повреждение живых клеток, прорастание спор или автолиз, что осложнит отделение конечного продукта путем фильтрования. В описанном процессе фирмы IMC конечный продукт отделяют центрифугированием, устраняя эти проблемы.
Дрейк и Смис запатентовали процесс, также использованный в промышленном производстве ВТ в США. Они не соглашались с требованием Мегны об ограничении содержания питательных веществ в ферментационной среде до 3—4% и доводили их общее содержание до 6—10%. Кроме того, они не считали решающим полное использование углеводов и азота после начала споруляции. Типичная среда содержала 6,8% кукурузного крахмала, 0,64% сахарозы, 1,94% казеина, 4,7% кукурузного экстракта, 0,6% дрожжей и 0,6% фосфатного буфера. Поскольку некоторые компоненты были жидкими, фактическое содержание сухого вещества составляло 12,3%. Конечная жидкость перед сбором содержала 14*10в9 жизнеспособных спор в 1 мл; в других же опытах число спор превышало 15*10в9, В патенте утверждалась активность препарата против луговой совки, бабочки-медведицы и личинок комнатной мухи. К сожалению, выход продукта не был уточнен, а биоиспытания не были стандартизированы, и, таким образом, невозможно определить, какое количество активного материала было произведено.
В этом же патенте, помимо описания процесса ферментации, содержатся два важных наблюдения, а именно: 1) экзотоксин осаждали из ферментационных жидкостей добавлением CaCl2 или BaCl2 и 2) смесь телец-включений и водорастворимых токсинов после удаления из нее спор сохраняла активность против бабочки-медведицы, совок и личинок комнатной мухи. В одном интересном опыте из профильтрованной ферментационной жидкости, якобы свободной от спор и кристаллов, был выделен водорастворимый продукт, активный против совок.
Существуют и другие патенты на производство ВТ методом глубинной ферментации. Боннфуа запатентовал способ производства спор и токсинов в аэрируемой жидкой среде, содержащей 0,6—1% азота аминокислот, 1—2% сахара и следы кальция, цинка, марганца и магния. Продукт высушивали и смешивали с соответствующими наполнителями для получения порошка. Фирма Shell Internationale Research получила патент на среду, состоящую из 2,3% казеина, 1,0% мелиссы и 2,3% Скотаферм (побочный продукт спиртовой ферментации), утверждающий, что для ферментаций можно использовать любой из ряда штаммов ВТ, смешивая затем конечные продукты разных ферментаций, но с оговоркой, что по крайней мере один из компонентов смеси должен быть продуктом ферментации серотипа IX. Последнее требование серотипа IX непонятно и не подтверждается опытом автора.
Маджумбер утверждает, что вирулентность ВТ полностью зависела от образования «жизнеспособных спор и связанных с ними параспоральных ромбоидальных кристаллов», и добавляет, что споруляция зависела от присутствия в среде не менее 0,025 D-ксилозы. При этом не принималась во внимание самостоятельная активность кристалла. Маджумбер предлагал также проводить испытания путем инъекции спор в полость тела тараканов. Ho и здесь, если споры вызывали бы септицемию, жизненно важный барьер — стенка кишечника — не принималась бы во внимание и активность кристаллического токсина не была показана.
Статья и упомянутые патенты касались главным образом производства спор ВТ. Однако некоторые исследователи указывали на разницу в инсектицидной активности разных серотипов и препаратов ВТ. Использованный изолят ВТ и условия ферментации на полутвердой среде влияли на продукцию кристаллов и их выход зависел не только от роста микроорганизма. Далмедж изучал образование кристаллов в глубинных культурах различных штаммов ВТ, и эти результаты показаны в таблице 38. Продукция инсектицидной активности (обусловленной главным образом токсином) зависела как от штамма, так и от среды. Ни один штамм и ни одну среду нельзя было признать абсолютно лучшей. Большинство культур давало более высокие выходы (DDU50/л) на среде Профло, но разновидности dendrolimus и tolworthi вырабатывали больше токсина на триптоновой среде. Если оценивать культуры, выращиваемые только на триптоновой среде, то лучшие результаты дает tolworthi, но на среде Профло наилучшей является thuringiensis. Эффективность производства, измеряемая в единицах DDU50/10в9, колебалась у разных культур и в пределах одной культуры — при разных средах. Поскольку между продукцией спор и инсектицидной активностью не обнаружено корреляции, эти данные подчеркивают опасность оценки результатов ферментации по числу спор.
Глубинная ферментация Bacillus thuringiensis

Новейшим достижением в промышленном производстве кристаллического токсина были использование нового выделенного штамма ВТ var. kurstaki HD-1, о чем сообщал Далмедж, и разработка процесса отделения спор и кристаллов. Среды, которые Далмедж применял при изучении HD-1, указаны в таблице 39, Они были выбраны не как лучшие для производства токсина, а как образцы сред, поддерживающих рост изолятов ВТ. Среды Профло и из соевой муки экономичны при промышленном производстве, но триптоновая среда невыгодна. В таблице 40 приведена технологическая схема процесса отделения конечного продукта, которую можно суммировать следующим образом: всю ферментированную массу центрифугируют для отделения спор и кристаллов. Центрифугат взбалтывают до взвеси в 4—6%-ном растворе лактозы и осаждают ацетоном (четыре объема). Лактоза, осаждаемая вместе с кристаллами и спорами, предупреждает образование комков и облегчает ресуспендирование конечного продукта. Осадок отделяют фильтрованием при отсасывании на воронке Бюхнера, пользуясь бумагой Ватман № 1. Мелкозернистый материал для этого не требовался. Осадок промывают ацетоном и высушивают.
Глубинная ферментация Bacillus thuringiensis

Продукт, отделенный вышеописанным способом, получил наименование препарат HD-1. Далмедж исследовал выход кристаллического токсина по отношению к числу спор и сравнил результат с данными для двух экспериментальных промышленных препаратов и для французского стандарта Е-61. Хотя число спор во всех четырех препаратах было одинаковым, содержание токсина в HD-1 оказалось необычно высоким (табл. 41). В настоящее время лаборатории Эббота и фирма IMC производят HD-1 в промышленном масштабе.
Глубинная ферментация Bacillus thuringiensis

Результаты сравнительных биоиспытаний промышленного препарата HD-1 и двух других препаратов приведены в таблице 42. Повышенная активность этого препарата, измеренная в биоиспытаниях, подтверждена полевыми опытами.
Глубинная ферментация Bacillus thuringiensis

Таким образом, при глубинной ферментации выход кристаллов повышался. Поскольку продукция токсина зависит от штамма и изменений условий ферментации, можно ожидать, что в будущем выход продуктов будет заметно повышен. Это должно привести к производству более активных препаратов при меньшей стоимости и тем самым к расширению использования этого ценного микробиологического инсектицида.
Глубинная ферментация Bacillus thuringiensis