01.09.2017
31.08.2017
08.08.2017
14.07.2017
06.07.2017
19.06.2017
19.06.2017
19.06.2017
15.06.2017
12.06.2017
Bacillus thuringiensis
 21.06.2014

В октябре 1956 г. Э. А. Штейнхаус встретился с Р. А. Фишером и Дж. М. Сударским из фирмы Pacific Yeast Products (позднее превратившейся в «Биоферм корпорейшн») для организации экспериментальной работы по глубинной ферментации Bacillus thuringiensis var. thuringiensis, в результате которой появился препарат турицид. Вскоре после этого некоторые другие фирмы начали производить конкурирующие продукты, а еще через несколько лет все они, кроме Биоферм и Nutrilite Products, прекратили эту работу.
Первоначальные полевые исследования препарата и изучение его безопасности, включавшее испытание препарата на добровольцах, были проведены с 1956 по 1958 г., когда Управление по контролю за качеством продовольствия и медикаментов (FDA) временно освободило биопрепараты от контроля за количеством допустимых остатков, a PRD разрешило в качестве опыта применение В. thuringiensis на овощных и кормовых культурах.
14 апреля 1960 г. FDA полностью сняло все ограничения и разрешило применять промышленные препараты ВТ на продовольственных и кормовых культурах.
Теперь посмотрим, какая экспериментальная работа необходима для получения разрешения на регистрацию препарата. В 1959 г. Штейнхаус сообщал, что Браун и др. испытывали В. thuringiensis var. thuringiensis и разновидности alesti, sotto, entomocidus и subtoxicus, пытаясь отобрать штаммы, патогенные для мышей. Они применяли тот же метод, которым пользовались Браун и его коллеги при работе со штаммами Bacillus cereus. Цитируем Штейнхауса: «За исключением двух случаев гибели, наступившей сразу после инокуляции и вызванной, как было установлено, не бактерией, а другой причиной, ни один из штаммов (В. thuringiensis) после культивирования на декстрозно-кровяной среде не обладал токсичностью или патогенностью для мышей. Д-р Браун приходит к заключению, что в условиях, указанных им и его коллегами в их статье, эти штаммы не могут быть превращены в патогенные для мышей».
В инспекторских да и в научных кругах всегда существовало опасение, что в результате какой-либо стимуляции или отбора возбудители болезней насекомых могут превратиться в формы, патогенные для позвоночных животных; подобные опасения — частый результат неправильной информации или непонимания генетики подобного процесса. В упомянутой ранее статье Брауна и др. авторы описывали работу со штаммами В. cereus, в ходе которой они путем отбора на средах подходящего состава получали вирулентные штаммы из популяций, которые были полностью авирулентны. В подобном случае изменение представляет собой одноступенчатый процесс, связанный с патогенностью. Поскольку Браун испытывал вероятность такой способности ВТ и не обнаружил в испытанных популяциях способности становиться патогенными для позвоночных, можно кончить с этой стороной вопроса.
Каковы же возможности развития вирулентных штаммов ВТ, патогенных для позвоночных? На это лучше всего ответил Штейнхаус: «Обычно считается, что встречающиеся в природе патогены относительно стабильны в генетическом смысле; это означает, что их специфическая ценность в определенной среде может отражать постепенное накопление ряда генетических детерминант, определяющих специфическую приспособленность данного штамма к размножению в конкретной среде. Чтобы получить вариант, в высокой степени приспособленный к совершенно иной среде, теперь потребовались бы скорее соответствующие изменения в ряде детерминант, чем просто одно генетическое изменение, приводящее к превращению авирулентного типа в тип, патогенный для позвоночных. А поскольку известно, что генетические детерминанты изменяются относительно медленно, вероятность ряда изменений, необходимых для приспособления потенциальных вариантов к иной среде, исключительно мала».
На основании того, что нам известно о патогенах насекомых, я считаю, что замечания Штейнхауса особенно хорошо приложимы к вирусам насекомых: они, видимо, верны и в отношении кристаллообразующих бактерий. Однако они могут быть неприменимы ко всем энтомопатогенным грибам, простейшим и риккетсиям, что будет во всей полноте рассмотрено в следующих разделах.
Большая часть экспериментальной работы по проверке безвредности ВТ изложена в статье Фишера и Рознера. Следует дать краткую сводку этих данных. В этой работе испытывался штамм В. thuringiensis NRS996, который Маттес выделил в 1927 г. Споры смешивались с наполнителем — диатомовой землей. В ходе испытаний наполнитель сам оказывал некоторое токсическое действие на растения, особенно когда применялись большие дозы. Этот продукт, получивший название турицид, использовался в большинстве опытов в концентрации 9*10в9 жизнеспособных спор в 1 г; концентрация определялась методом подсчета на пластинках. В опытах на людях применялась концентрация 3*10в9 жизнеспособных спор в 1 г.

Bacillus thuringiensis

а. Вирулентность турицида после серийных пассажей через мышей. Мышам производили внутрибрюшинные инъекции, после чего через 6 ч путем сердечной пункции у них бралась кровь, которую инъецировали в брюшину второй группы мышей. Этот серийный пассаж был повторен на пяти группах мышей, и ни у одной из конечных групп никаких ненормальных симптомов не наблюдалось. Поскольку в первой тест-группе была отмечена одна смерть, бактерия и наполнитель были испытаны раздельно методом внутрибрюшинной инъекции. Ни одна из мышей, которым был инъецирован препарат, не погибла, но инъекции наполнителя вызывали токсические симптомы при очень сильном раздражении брюшины.
б. Сохраняемость ВТ в крови мышей. Белым мышам были сделаны внутрибрюшинные инъекции ВТ и В. cereus. Сердечные пункции производили через предварительно установленные интервалы, после чего кровь высевали на триплин-глюкозный агар. Через 48 ч ВТ и В. cereus еще имелись в крови, но через 72 ч обе бактерии исчезли.
в. Проверка патогенности ВТ при парентеральном введении морским свинкам. Морским свинкам производили внутрибрюшинные инъекции вегетативных клеток ВТ, В. cereus и Bacillus subtilis. В таблице 34 показано, что морские свинки переносят высокие дозы бактерий из бульонной культуры, но ряд животных погиб от больших доз культур на косом агаре.
г. Проверка токсичности для мышей при ингаляции. В течение четырех различных сроков мышей подвергали воздействию 1 г турицида; обработка проводилась в камере площадью 30 см2, в которую был встроен распылитель. Никаких неблагоприятных симптомов или изменений в питании или весе обнаружено не было, и общие патологические исследования дали отрицательные результаты.
д. Проверка турицида на аллергенность для морских свинок. Морских свинок подвергали воздействию доз, вызывающих появление аллергии, двумя способами: 1) путем интрадермальных инъекций и 2) абразивным методом. Применялось также поверхностное воздействие на неповрежденную кожу. У животных, перенесших инъекцию и обработку абразивным методом, была отмечена слабая эритема, свидетельствующая о местном раздражении. Проверочные дозы, применявшиеся через 2 недели после последней обработки, на аллергию никакого действия не оказали. Поверхностное применение турицида также было неэффективным.
е. Вдыхание и заглатывание турицида добровольцами. Восемнадцать добровольцев прошли медицинский осмотр и лабораторное обследование, после чего в течение пяти дней ежедневно принимали по 1 г турицида. В дополнение к этому пятеро пациентов в течение пяти дней вдыхали ежедневно по 100 мг порошка. Затем все лица, подвергнутые обработке, снова прошли тщательное медицинское обследование, повторенное через 4—5 недель. Все люди, подвергшиеся испытаниям, были совершенно здоровы, и все широкие лабораторные тесты дали отрицательные результаты.
Данные, полученные на людях, включали также сведения о восьми служащих, имевших дело с бактериальными препаратами в ходе изготовления последних. В некоторых случаях общая продолжительность экспозиции составляла 25 ч. Весь персонал оставался совершенно здоровьем, и никакого вреда от соприкосновения с препаратом обнаружено не было.
ж. Проверка на острую пероральную токсичность турицида. 33%-ные суспензии турицида вводили непосредственно в желудки крыс. Использованные дозы турицида составляли до 24 г (2*10в12 спор на 1 кг веса тела). По прошествии недели ни случаев смерти, ни симптомов интоксикации Отмечено не было, и общие патологические исследования дали отрицательные результаты.
Помимо этого, Фишер и Рознер сообщили, что тесты, проведенные другой группой ученых, показали, что в опытах с кормлением, проведенных с целью изучения острой и хронической токсичности турицида, никакого токсического действия на цыплят, кур-несушек, поросят и свиней, рыб, взрослых медоносных пчел и их личинок отмечено не было. Опыты с медоносными пчелами, позволяют считать, что пчелы страдают лишь от таких высоких концентраций экзотоксина, какие в практических условиях никогда не применяются.
Таким образам, на основании ходатайства Биоферм корпорейшн, включавшего часть приведенного выше описания опытов. Управление по контролю за качеством продовольствия и медикаментов 14 апреля 1960 г. освободило турицид от контроля за количеством допустимых остатков.