04.10.2017
04.10.2017
28.09.2017
01.09.2017
31.08.2017
08.08.2017
14.07.2017
06.07.2017
19.06.2017
19.06.2017
Микробиология термостабильного экзотоксина
 20.06.2014

Как и большинству других аспектов метаболизма В. thuringiensis, явлениям биосинтеза и регуляции, связанным с накоплением экзотоксина, уделялось мало внимания. Помимо заманчиво необычного метаболизма, который может участвовать в биосинтезе этого соединения само накопление экзотоксина в количествах, способных заинтересовать промышленность, оправдало бы тщательное изучение. К настоящему времени исследованы только некоторые из микробиологических аспектов.
Сообщалось, что биосинтез экзотоксина осуществляют главным образом штаммы серотипа I. Затем стало известно, что штаммы серотипов IVa и IVc, V и VII, IX и X также синтезируют это соединение. Из числа указанных серотипов синтез экзотоксина был подтвержден для серотипов I, IVa и IVc и V. Различные лаборатории не смогли подтвердить накопление экзотоксина серотипом VII. Имеются сообщения, что штаммы серотипа VIII также вырабатывают вещество или вещества, токсичные для мух. Однако в этом случае активность обусловлена, по-видимому, не экзотоксином. В первых сообщениях не было никаких данных о термостабильном пятне токсина на бумажных хроматограммах, приготовленных из бульонных культур серотипа VIII. В более поздних имеются описания характеристик токсичности бульонных культур серотипа VIII для Heliothis zea и Trichoplusia ni, отличные от нормальных характеристик штаммов, вырабатывающих экзотоксин.
Высказывалось предположение, что образование экзотоксина штаммами В. thuringiensis может оказаться подходящим признаком в качестве таксономического критерия. Ho это предложение, хотя и конструктивное, подверглось обоснованной критике. Главным возражением была необходимость использования косвенных доказательств — смертности мух, как свидетельства присутствия экзотоксина. Виды бактерий, не вырабатывающие экзотоксин, также способны убивать мух. При подобной ситуации можно полагать, что отсутствие приемлемого, специфического и чувствительного химического теста на полноценный, активный, точно определенный экзотоксичный компонент не позволяет считать образование этого соединения пригодным таксономическим критерием. Ho если будет предложен удовлетворительный метод испытания, пригодность этого признака для таксономии следует пересмотреть.
Внеклеточное накопление пуриновых оснований, нуклеозидов или нуклеотидов спорообразующими бактериями достаточно точно установлено. Накопления зависят от одного или от комбинации трех типов метаболической активности. Во всех случаях это связано с новым синтезом пуринового компонента (рис. 22). Первая система обычна для большинства накапливающих штаммов. Сюда относятся различные типы ауксотрофных мутантов, обычно нуждающихся в пуринах, предпочтительно в пуринах с добавлением аминокислот. Аминокислотная ауксотрофия требуется обычно для гистидина — аминокислоты, как известно, играющей регулирующую роль в циклах взаимных превращений пуриновых нуклеотидов. Пуриновая ауксотрофия такова, что накапливающиеся соединения представляют собой промежуточные вещества, предшествующие началу нарушения энзиматической системы, дефосфорилированные производные промежуточных соединений или соединения, накапливающиеся в результате блокирования одного из направлений многоканального метаболизма (например, ИМФ, КМФ или АМФ). Такие типы метаболизма могут комбинироваться с синтезом так называемого защитного фермента. Защитный фермент функционирует в направлении ресинтеза нуклеотидов из пуриновых оснований, образовавшихся в результате диссимиляции. Последний тип накопления, описанный для гуанозин-5'-монофосфата, является результатом внеклеточного ферментативного гидролиза выделенной РНК.

Микробиология термостабильного экзотоксина

Микробиология термостабильного экзотоксина

Общим для накопления экзотоксина в В. thuringiensis с описанными выше системами является только новый синтез пуринового компонента. Штаммы, накапливающие токсин, не являются пуриновыми ауксотрофами, хотя некоторые требуют аминокислот для роста. Опыты Коннера и Хансена и Шай и др. (табл. 25) показывают, что накопление может происходить не в результате деградации РНК. Таким путем может выражаться необычное явление накопления нуклеотидов штаммами дикого типа. Вторым пунктом, представляющим интерес и имеющим отношение к накоплению, будет то, что оно происходит в условиях, когда можно было бы ожидать, что нормальная обратная регуляция синтеза нуклеотидов будет лимитировать накопление таких соединений. Шай и др. изучали нуклеотидный обмен у накапливающего экзотоксин штамма серотипа I. В этих исследованиях некоторые производные пуринов, регулирующие направление биосинтеза (рис. 22), вводились в культуральную среду штамма серотипа I (табл. 25). Авторы установили, что такие добавки уменьшали накопление экзотоксина. Следовательно, в штамме действует нормальная обратная регуляция по крайней мере в неуравновешенных условиях. Это исследование позволило глубже проникнуть в сущность нуклеотидного обмена штамма. Шай и др. доказали, что у изучаемого штамма нормальные пути диссимиляции, участвующие в деградации нуклеотидов (табл. 26).
Микробиология термостабильного экзотоксина

Можно было ожидать, что в системе наблюдавшегося типа, где происходит нормальная диссимиляция, т. е. имеет место активность нуклеотидазы, не будет происходить накопления нуклеотида. Опыты Шая и др. показали, что сам экзотоксин может быть устойчив к действию нуклеотидазы. Кроме того, было показано, что экзотоксин сам подавляет активность нуклеотидазы. Это было продемонстрировано добавлением экзотоксина к суспензиям покоящихся клеток, инкубированным с АМФ или ИМФ. Было также измерено освобождение неорганического фосфора (Pi) из соединений (табл. 27). Отмечено, что подавление освобождения Pi из АМФ предотвращалось почти полностью, а из ИМФ — лишь частично.
Микробиология термостабильного экзотоксина

На основе этих наблюдений Шай и др. частично объяснили накопление экзотоксина синтезирующими его штаммами В. thuringiensis. Накопление этого соединения не является следствием ни мутационной блокады ферментативного этапа биосинтеза нуклеотида, ни отсутствия ферментов, участвующих в нормальном катаболизме нуклеотидов. Экзотоксин сам может обладать устойчивостью к действию нуклеотидазы и может действовать как конкурирующий ингибитор нуклеотидаз. Подавление нуклеотидазы привело бы к снижению скорости катаболического образования пуриновых оснований, аденина и гуанина. Эти пурины регулируют образование ИМФ, АМФ и КМФ (рис. 22). Низкая внутриклеточная концентрация этих оснований не препятствует более или менее непрерывному синтезу КМФ и АМФ. Большая часть ИМФ, вероятно, поступает через АМФ-канал биосинтеза, поскольку синтез экзотоксина быстро удалил бы АМФ, продукт реакции, из системы, сдвинув равновесие в сторону этого реагирующего вещества. Это основано на предположении, что АМФ является предшественником экзотоксина. Тогда клетка, накапливающая экзотоксин, имитирует катаболически блокированный мутант. Этим можно объяснить накопление экзотоксина клетками, нормально чувствительными к механизмам обратной регуляции, которые, как известно, действуют в этих бациллах. Конкуренцию со стороны экзотоксина за участки действия фермента, участвующего в метаболизме АТФ в ферментной системе Escherichia coli (РНК полимераза, зависящая от ДНК), наблюдали также Шебеста и Горска. Их наблюдения подтверждают роль этого соединения в вышеприведенной метаболической схеме. Возможно, ее стоит также несколько экстраполировать по отношению к механизму действия.
В литературе имеется мало других данных, представляющих ценность для микробиологии. Исследования Коннера и Хансена позволяют вывести корреляцию между накоплением экзотоксина и физиологическим состоянием, измеряемым ростом. Ни одно из указаний на результат добавления отдельных аминокислот нельзя было рассматривать как основу продукции. Поэтому влияние отдельных аминокислот только на синтез экзотоксина, а не на рост не отмечается.
Из вышеизложенного ясно, что в наших знаниях о путях биосинтеза и системах регуляции, участвующих в синтезе экзотоксина, имеется много пробелов. Эти системы крайне интересны, и можно надеяться, что в ближайшем будущем будут выяснены связанные с ними механизмы.