04.10.2017
04.10.2017
28.09.2017
01.09.2017
31.08.2017
08.08.2017
14.07.2017
06.07.2017
19.06.2017
19.06.2017
Очистка термостабильного экзотоксина
 20.06.2014

Весьма высокая концентрация материала в надосадочной жидкости после центрифугирования жидких культур сильно упрощает очистку экзотоксина. Нормальный штамм var. thuringiensis, выращиваемый без каких-либо попыток увеличить выход токсина, обеспечивает в надосадочной жидкости концентрацию 50 мг/л. Однако очень трудно установить химическую однородность экзотоксина. Эта проблема в большинстве случаев игнорировалась.
Важнейшим этапом во всех опубликованных методах очистки, кроме метода Бенца, является адсорбция экзотоксина на древесном угле и элюирование из него. То, что этот процесс может служить для частичной очистки или концентрирования экзоксина, впервые косвенно указали Дрейк и Смис в 1961 г. в описании патента, где было также сказано, что соли некоторых металлов могут осаждать экзотоксин непосредственно из надосадочной жидкости бактериальных культур. Из этих металлов были названы магний, кальций и барий. Процедуры, описанные Дрейком и Смисом, не предназначались для очистки экзотоксина; это было лишь описание ряда способов концентрации экзотоксина из надосадочной жидкости в форме, удобной для использования в качестве инсектицидов. При первой попытке очистки, предпринятой де Баржаком и Дедонде, надосадочную жидкость освобождали от клеток, спор и других твердых веществ, концентрировали в 6 раз путем выпаривания при пониженном давлении и автоклавиро-вали в течение 15 мин при 120°. Концентрат адсорбировали на промытом кислотой древесном угле, который отмывался 0,01 M этиленди-аминтетрауксусной кислотой и дистиллированной водой. Фракцию, токсичную для капустной совки, извлекали из промытого угля 50%-ным водным этанолом. Эту фракцию после концентрирования хроматографировали на бумаге Ватман № 1 в системе этанол : 1 M уксуснокислый аммоний при pH 3,8. Полосу Rаденозин 0,13 вырезали и смывали дистиллированной водой. Хроматография на бумаге токсического элюата в четырех других системах в каждом случае давала только одно пятно, поглощающее ультрафиолетовые лучи (УФ) с длиной волны примерно 260 нмк.
Ультрафиолетовые спектральные характеристики элюата истолковывались как показатель присутствия адениннуклеотида. Далее, элюат дал положительный результат при пробе (детали которой не уточнены) на фосфат и при гидролизе (условия не указаны) — соединение, спектральные и хроматографические свойства которого были идентичны свойствам аденина. Очень мягкий гидролиз токсического элюата (0,1 н. H2SO4; 20 мин при 100°) дал фрагмент, который хроматографировался вместе с рибозой и давал такие же, как рибоза, цветные реакции. Де Баржак и Дедонде показали, что в токсическом элюате аденин, фосфат, рибоза (определяемые орсиноловым методом, позволяющим измерять количество как связанной, так и свободной рибозы) и после гидролиза «восстанавливающие группы» присутствовали в молярном соотношении 1:1, 2:1, 4:1,4. Условия выделения 1,4 моля «редуцирующих групп» (0,1 н. HCl; 60 мин при 100°) показывают, что выход свободной рибозы, определенный хроматографически, вероятно, количественно неполон.
Через несколько месяцев после появления отчета де Баржака и Дедонде Бенц описал способ очистки, который остается уникальным, поскольку здесь не используются ни адсорбция на древесном угле, ни осаждение солями тяжелых металлов. Надосадочную жидкость центрифугированной культуры В. thuringiensis концентрировали путем кипячения до 1/10 объема. Это очень точный метод испытания термостабильности экзотоксина, и жаль, что Бенц не провел количественного определения снижения токсичности. К концентрату порциями добавляли этанол и выпадающий осадок удаляли. В конце концов при концентрации спирта 90% (по объему) в осадок выпадала токсическая фракция. Ее отделяли, снова растворяли в воде и затем очищали путем хроматографии на колонке целлюлозы, из которой его элюировали 80%-ным водным раствором этанола или путем ионообменного фракционирования на смоле Доуэкс-2 (форма смолы не уточнена) при последовательном элюировании водой, 10%-ньгм водным раствором уксусной кислоты и 5% КОН.
Токсические фракции, выделенные методами де Баржака и Дедонде и Бенца, имеют одинаковые УФ-спектры. Цветные реакции показали, что токсин Бенца содержал альдопентозу.
Метод очистки Шебесты и др. заключается в адсорбции древесным углем центрифугированной бактериальной надосадочной жидкости, извлечении из древесного угля водным раствором этанола с последующим фракционированием на муравьинокислом Доуэксе-1 и извлечением 0—1,5 M буферным раствором муравьинокислого аммония. Выделенный таким образом продукт содержит аденин и фосфат в отношении 1:1,2. Однако Шебеста и др. не обнаружили рибозы в продуктах гидролиза своего токсина. При хроматографировании в системе изомасляная кислота : вода : аммиак их экзотоксин вел себя необычно. Бонд и Бойс наблюдали и пытались объяснить сходное поведение их экзотоксина в системе этанол : 1 M уксуснокислый аммоний при pH 3,8, но де Баржак и Дедонде не сообщали об аномальном поведении экзотоксина в этой системе.
В 1968 г. де Баржак и Дедонде описали свой второй метод очистки, включавший осаждение (солями ртути), адсорбцию на древесном угле и ионообменную хроматографию на Доуэксе-1 (хлориде). Любопытная особенность этой новой работы французской группы заключается в том, что, если раньше они извлекали токсин из древесного угля 50%-ным водным этанолом, теперь они использовали этот растворитель для удаления примесей, а токсин извлекали «аммиачным этанолом». Древесный уголь действительно крайне разнообразен по свойствам. В этой второй статье молекулярный вес экзотоксина указан в пределе от 700 до 800. Экзотоксин присоединял два моля перйодата.
Шебеста и др. представили позднее более детальное описание их метода очистки, внеся незначительные изменения.
При очистке по методу Бонда и др. использовалось осаждение барием, адсорбция на древесном угле при pH около 1, извлечение из него 50%-ным водным раствором этанола с добавлением 1% концентрированного аммиака, адсорбция на смоле Доуэкс-1 (Cl-) или пермутит FFIP (Сl-), извлечение 0,1 н. HCl, содержащим 0,1 M NaCl и обессоливание нейтрализованного (аммиаком) элюата на сефадексе G-10. Остающиеся примеси удаляются или путем подготовительной тонкослойной хроматографии на целлюлозе и силикагеле, или путем хроматографии на DEAE-целлюлозе. Сочетание осаждения барием с адсорбцией на древесном угле быстро и удобно обеспечивает стократную очистку. Первоначальная концентрация экзотоксина в бактериальной надосадочной жидкости составляет примерно 50 мкг/л, а общий выход — 36%. Количественные данные по этому методу очистки приведены в таблице 24. К сожалению, нет никаких сопоставимых данных по другим методам.

Очистка термостабильного экзотоксина

Способ очистки Бонда и Бойса не требует большого мастерства и фактически никакого навыка, вплоть до обессоливания элюата на сефадексе G-10. Этот процесс был при первой попытке завершен за 3 дня опытным лаборантом, начавшим его со 120 л культуральной среды. Придерживаясь описания способа в статье, начинающий лаборант мог после двухнедельного обучения проводить эти этапы очистки. Однако подготовительная тонкослойная хроматография требует достаточно высокой квалификации и опыта. Разделение на DEAE-целлюлозе требует меньшей точности, особенно если загрузка невелика, и его может проводить каждый, кто знаком с хроматографией.
Метод Шебесты и др. также прост и ясен, но здесь нужно учитывать одно возможное осложнение, которое может остаться незамеченным. Качество очистки зависит от хорошего разделения при хроматографии на Доуэксе-1. В связи с размерами молекул экзотоксина наилучший результат дают смолы с малым количеством поперечных связей. Использование растворителей с возрастающей ионной силой может вызвать сжатие и расширение смолы, поэтому необходимо следить за тем, чтобы разделение не задерживалось.