04.10.2017
04.10.2017
28.09.2017
01.09.2017
31.08.2017
08.08.2017
14.07.2017
06.07.2017
19.06.2017
19.06.2017
Методики биологических испытаний термостабильного экзотоксина
 20.06.2014

В недавнем обзоре Хеймпела приводится обширный список видов насекомых, считающихся восприимчивыми к неочищенной стерильной надосадочной жидкости из центрифугированной культуры В. thuringiensis. Из них Mamestra brassicae, Galleria mellonella, Drosophila melanogaster и Musca domestica наиболее интенсивно использовались для количественных испытаний и для контроля четырех описанных методов очистки экзотоксина. Ниже суммируются некоторые из важнейших особенностей каждого метода испытания.
Mamestra brassicae часто разводят на капустных растениях в теплице, хотя ее можно разводить и на синтетическом корме, разработанном для Pieris brassicae. Метод испытания, описанный Бюржержоном и де Баржаком, включает опрыскивание испытуемым препаратом дисков из капустных листьев и оставление на них гусениц 3-го возраста на 2 дня. Подсчет мертвых гусениц производится не раньше чем через 8 дней. Смертность в контроле составляет около 10%.
Galleria mellonella можно разводить в лаборатории на синтетическом корме (среда Хейдака); это преимущество подчеркивали МакКоннелл и Ричардс и Шебеста, Горска и Ванкова. Метод испытания, включающий инъекцию взрослым гусеницам (5-го или 6-го возрастов) до 10 мкл испытуемого раствора, описали обе группы, а также Ванкова и Шмид и Бенц. Второй метод, при котором экзотоксин включают в среду Хейдака и скармливают ее личинкам, описали несколько авторов, в том числе Ванкова, Крит и Шмид и Бенц. Результаты этих последних авторов ясно показывают, что инъекция — значительно более чувствительный метод (примерно в 250 раз), и его преимущество в том, что личинке вводится определенная доза, хотя это, конечно, не означает, что вычисленная летальная доза определена точно. Определить, сколько времени должно пройти до тех пор, когда можно учитывать результаты опытов, нелегко. Большинство авторов ведут наблюдения до 14 дней, но Шебеста, Горска и Ванкова утверждают, что этот срок можно сократить до 48 ч. При методе инъекций смертность в контроле бывает очень благоприятна и не превышает 5—10%, но сам метод требует известного мастерства, Этот вид, как и М. brassicae, очень чувствителен к действию кристаллического токсина В. thuringiensis, который поэтому следует тщательно удалить из испытываемых материалов. Это легко достигается автоклавированием или применением мембранных фильтров.
Drosophila melanogaster, которую очень легко разводить, можно также использовать в качестве тест-объекта; Криг и Бенц и Перрон описали соответствующие методы испытаний. Экзотоксин включают в среду для личинок, которой может служить кукурузно-дрожжевой агар или синтетическая среда Занга. Бенц и Перрон отмечают, что пользоваться синтетической средой следует осторожно, поскольку некоторые фирменные сорта одного из ингредиентов — казеина — летальны. На лучших средах смертность в контроле составляла только 5%. Они доказали также, что дрожжи могут снижать эффективность экзотоксина. В опытах по определению относительной силы действия препаратов это не имеет значения, но может вызывать изменение абсолютной силы действия. Требуемая продолжительность экспозиции для этого вида не указывалась.
Musca domestica также легко разводится и имеется повсюду. Первые исследователи помещали мух на экскременты крупного рогатого скота, что служило мерой оценки практической ценности экзотоксина, но Кантвелл и др. описали значительно более удобный метод испытания. При этом методе определенное число личинок 3-го возраста помещают на среду, состоящую из смеси молока с водой в отношении 1:1,2% дрожжей по объемному весу и известного количества неочищенного экзотоксина; все это абсорбируется ватой. Продолжительность экспозиции и здесь не указывается, но, пользуясь сходным методом, Бонд и Бойс определяли результаты опыта по общему числу взрослых насекомых, вылетевших через 7 дней при 30 °C. В контроле реакция отмечалась в среднем только у 2%. Они описали также более быстрый метод, при котором яйца М. domestica помещают на молочно-дрожжевой агар, обработанный экзотоксином. Реакция определяется через 48 ч по подавлению перехода личинок в 3-й возраст. Недостатком метода является относительно плохая воспроизводимость, а иногда и высокая смертность в контроле; поэтому лучше применять его только для получения полуколичественных результатов.
При пользовании всеми описанными методами испытания реакция насекомых следует линейной вероятностной зависимости эффекта от логарифма дозы, из которой можно при помощи общеизвестных методов вычислить значения ЛД50 или отношение эффективностей. Для полного статистического анализа результатов можно использовать также программы для счетно-решающих устройств, выдающие ЛД10, ЛД50, ЛД90 и т. д., и их уровни достоверности, крутизну наклона β и χ2.

Методики биологических испытаний термостабильного экзотоксина

Сравнивать точность различных испытаний пока не представляется возможным, поскольку результатов подобных опытов опубликовано очень мало. Бонд и др. нашли, что абсолютное значение ЛД50 раствора экзотоксина колебалось почти до удвоения при испытании в четырех различных опытах с использованием более длительного количественного метода на М. domestica. Относительная эффективность того же самого раствора в сравнении со стандартным раствором чистого экзотоксина была лучше воспроизводимой (табл. 22). Они вычислили также число повторностей, требующихся для обнаружения возможных различий в отношениях эффективности. Так, например, требовалось четыре повторности для шести доз, при 20 личинках на дозу, чтобы обнаружить 30%-ную разницу в активности растворов и показать, который из них более активен. Данные о других отношениях эффективностей приведены в таблице 23.
Методики биологических испытаний термостабильного экзотоксина

Дальнейшие биологические испытания экзотоксина будут сильно упрощены, если окажется возможной какая-либо форма стандартизации, чтобы избежать массы противоречий и неясностей, присущих начальным исследованиям экзотоксина. Охотно поддерживаем рекомендации Бюржержона и предложение Барджеса и др., выдвинутое на Международном коллоквиуме по патологии насекомых и микробиологической борьбе в Вагенингене в 1966 г. об использовании стандарта и выражении результатов испытаний в форме относительной эффективности. Преимущество перед стандартным методом биологических испытаний заключается в том, что отпадают многие проблемы, связанные со стандартизацией испытания, и когда испытывается только один токсин, результаты не зависят от применяемого метода, и, следовательно, методику можно видоизменить, как покажется необходимым. Теперь, когда доступен чистый экзотоксин, он может служить эталоном, и мы сохранили часть его для использования в качестве стандарта в биологических испытаниях. Мы предоставим всем заинтересованным лицам образцы весом в 1 мг.