01.09.2017
31.08.2017
08.08.2017
14.07.2017
06.07.2017
19.06.2017
19.06.2017
19.06.2017
15.06.2017
12.06.2017
Первоначальные противоречия в отношении термостабильного экзотоксина
 20.06.2014

Активность, обнаруженная Мак-Коннеллом и Ричардсом, и та, что установили Бюржержон и де Баржак, часто считается идентичной, несмотря на разницу в эффективных способах введения. Кроме того, часто считают непреложным, что подавление развития личинок мух, вызываемое автоклавированной надосадочной жидкостью культуры В. thuringiensis, обусловлено действием того же токсина. Соответственно существует тенденция использовать как синонимы такие термины, как фактор Мак-Коннелла и Ричардса, жаростойкий токсин, термостабильный токсин, экзотоксин В. thuringiensis, мушиный фактор, мушиный токсин и т. д.
Доказательства в пользу идентичности или различия этих материалов можно разделить на три группы: данные количественных биологических испытаний, результаты качественных испытаний и результаты химических анализов. Утверждения в литературе почти целиком основаны на данных первой группы, но они неубедительны, поскольку почти не делалось попыток стандартизировать условия испытаний, чтобы иметь возможность достоверного количественного сравнения полученных результатов.
Слишком часто в опытах одновременно изменяли штамм бактерии, технологию ферментации, насекомых-тестеров и способы введения. Очень часто испытываемые материалы и методы испытаний описывались неточно, а в некоторых случаях не были указаны даже такие основные данные, как применявшаяся доза и продолжительность экспозиции. Примером этих многочисленных промахов может служить кажущаяся невосприимчивость G. mellonella к перорально вводимой надосадочной жидкости. Поскольку в каждом случае использовали лишь очень небольшую серию доз, возможно, что они были недостаточны, чтобы вызвать реакцию. Вероятность этого видна из результатов работ Ванковой, Крига и Шмида и Бенца, показавших, что личиночные стадии этого вида поражаются при пероральном применении препарата.
Использовав достаточно хорошо очищенный «экзотоксин» и применив изящный метод биологического испытания на Drosophila melanogаster, Шмид и Бенц установили, что «экзотоксин», скормленный гусеницам вощинной огневки, широко дезактивировался в организме гусениц и что пероральная доза для огневки была в 247 раз больше дозы для инъекции. Это означает, что вычисленная пероральная ЛД50 надосадочной жидкости Мак-Коннелла и Ричардса должна составлять 0,36х247 мкл или 89 мкл/гусеницу. К сожалению, установить, вводилась такая доза или нет, невозможно, потому что Мак-Коннелл и Ричардс указывают концентрацию надосадочной жидкости, добавленной к корму, но не указывают, какое количество корма было съедено. По-видимому, Хейтор давал не больше 15 мкл надосадочной жидкости (5 мкл сконцентрированной в 3 раза надосадочной жидкости), т. е. дозу, которая не должна оказывать заметного действия.
Кантвелл и др. применяли до 50 мг наполовину очищенного токсина, пытаясь воздействовать на G. mellonella перорально. Они применяли токсин из параспорина, промышленного препарата В. thuringiensis, поэтому нельзя точно установить, из чего именно состоял этот материал и какое количество надосадочной жидкости содержалось в максимальной использованной дозе 50 мг. Можно, однако, считать, что этот препарат был менее активен, чем совершенно неочищенная, лиофилизованная, стерильная надосадочная жидкость из культуры В. thuringiensis, которую использовали Бонд и Бойс и другие исследователи. Это сомнение ослабляет также и утверждение Кантвелла и др. о том, что: «поскольку Бюржержон и де Баржак, и Криг и Херфс нашли, что фильтраты из культур были эффективны в отношении чешуекрылых, разумно предположить, что, может быть, они измеряли действие какого-то другого токсина, поскольку мы не смогли добиться смертности Estigтепе acrea, Plodia interpunctella или G. mellonella при скармливании им до 50 мг наполовину очищенного токсина».
Во всяком случае, их аргументация весьма сомнительна уже и потому, что хотя Бюржержон и де Баржак и Криг и Херфс работали с несколькими видами бабочек, однако именно эти три указанных вида они не использовали.
Позднее Хеймпел, не располагая большим количеством доказательств, утверждал тем не менее, что все имеющиеся наблюдения относятся к одному- и тому же токсину. Мы согласны с тем, что основная масса доказательств говорит в пользу этого заключения. Это можно подтвердить следующими фактами.
Во-первых, симптоматология во всех наблюдавшихся случаях токсичности автоклавированной надосадочной жидкости культур В. thuringiensis очень сходна; как ни странно, этот аргумент обычно игнорировался, хотя на него не распространяются многие из возражений против имеющихся количественных данных.
Во-вторых, авторами недавно были получены количественные данные, связывающие результаты Мак-Коннелла и Ричардса для G. mellonella с результатами различных авторов, включая Кантвелла и др., использовавших для выявления активности токсина М. domestica. Так, при инъекции вощинной огневке стерильной надосадочной жидкости из бактериальной культуры ЛД50 составляла 0,17 мкл на 1 гусеницу (что эквивалентно 2,8 мкг высушенных лиофилизацией твердых веществ ферментированного материала); это вполне согласуется с данными Мак-Коннелла и Ричардса, которые для своей надосадочной жидкости указывают ЛД50 = 0,36 мкл на гусеницу. Когда авторы производили очистку надосадочной жидкости, контролируя этот процесс испытаниями на М. domestica, сила действия препарата возросла в общем в 255 раз, что полностью соответствовало коэффициенту 294, который мы получили, использовав в качестве насекомого-тестера вощинную огневку (табл. 20).

Первоначальные противоречия в отношении термостабильного экзотоксина

Если бы оба вида реагировали на различные токсины, отношение сил действия было бы, вероятно, в каждом случае иным. Результаты, приведенные в таблице 21, показывают, что тот же самый очищенный материал был активен перорально для многих видов насекомых, в том числе для Pieris brassicae, одного из видов бабочек, которых Бюржержон и де Баржак считали восприимчивыми. Кроме того, используя методы испытания, аналогичные тем, которые применяли Кантвелл и др., мы получили коэффициент 1,9 для концентраций, которые требовалось создать в средах для культур личинок Aedes aegypti и М. domestica (ЛД50 составляет соответственно 1,9 и 1 мг/кг). Он превосходно согласуется с отношением, равным 2,1, которое можно вывести на основании результатов Кантвелла и др. (850 и 400 мг/кг), чтобы добиться сходной реакции.
Первоначальные противоречия в отношении термостабильного экзотоксина

В-третьих, каждым из четырех опубликованных методов очистки выделялся только один токсин (см. ниже). Кроме того, Бонд и др. показали, что после шестиступенчатой процедуры очистки их очищенная фракция сохраняла лишь 36% первоначальной активности автоклавированной надосадочной жидкости. Пропуская повторно известное количество чистого материала через цикл очистительных процедур, они установили, что основные потери активности происходили по механическим причинам (в частности, в результате необратимой адсорбции на древесном угле), а не вследствие отделения от других токсических материалов.
Наконец, о чем будет подробно говориться ниже, физические и химические свойства токсинов, выделенных и изученных независимо друг от друга тремя группами исследователей (де Баржак и Дедонде; Бонд, Бойс и Френч и Шебеста, Горска и Ванкова), хорошо совпадают, несмотря на то, что использовались два разных штамма В. thuringiensis и совершенно различные методы биологических испытаний.
Поэтому мы должны принять термин «экзотоксин» для термостабильного токсина [120°/15 мин], выделяемого некоторыми штаммами В. thuringiensis в культуральную жидкость.