01.09.2017
31.08.2017
08.08.2017
14.07.2017
06.07.2017
19.06.2017
19.06.2017
19.06.2017
15.06.2017
12.06.2017
Механизм действия и токсичность кристалла белкового токсина В. thuringiensis
 20.06.2014

Действие кристалла на гусениц чешуекрылых хорошо изучено, и Хеймпел и Ангус составили обзор по этому вопросу. На серии рентгеновских снимков Хеймпел и Ангус показали, что у гусениц, заглатывавших BaSO4 и кристаллы В. thuringiensis, возникал паралич кишечника. Паралич ротовой области и кишечника наблюдается у многих видов. Эти же авторы продемонстрировали общий паралич тела у гусениц Bombyx mori через 1—7 ч после заглатывания кристаллов, но такое действие кристаллы оказывают лишь на немногие виды.
Паралич кишечника сопровождается обширными изменениями кишечного эпителия. Уайт показал, что иммунофлуоресцентные кристаллы притягиваются к клеткам эпителия в течение немногих минут после поступления в среднюю кишку, и у Р. brassicae это вызывает интенсивную секреторную деятельность. Броерсма и Бакстон выяснили, что клетки эпителия средней кишки металловидки, Trichoplusia ni, выглядели обезвоженными и эродировались. Они отделялись друг от друга, а затем и от базальной мембраны. Некоторые из клеток деформировались, теряли способность окрашиваться, и в конце концов их содержимое вытекало. Саттер и Раун установили сходное действие на стеблевого мотылька Ostrinia nubilalis. Кроме того, вегетативные палочки В. thuringiensis нападали на разрушенный эпителий средней кишки и проникали в базальную мембрану. Когда содержимое кишечника смешивалось с гемолимфой, гусеницы погибали, но причиной смерти не обязательно была бактериемия. Ангус исследовал кишечный эпителий гусениц Bombyx mori в нефиксированном, взвешенном состоянии. После погружения гусениц на 10 мин в воду, чтобы вызвать аноксию (недостаток кислорода в гемолимфе), из средней кишки вырезали полосы клеток и исследовали их в изотоническом солевом растворе Локка в фазово-контрастном микроскопе. Клетки из контрольных гусениц держались вместе в неразрывном слое, и клеточные оболочки выглядели целыми. Напротив, полосы клеток из обработанных гусениц содержали клетки с разрушенными оболочками. Содержимое многих клеток вытекало в жидкость, в которой они были суспендированы. Уайт продемонстрировал агрегацию радиоактивных частиц из меченных тритием кристаллов у основания разрушенного эпителия через 18 ч после того, как гусеницы Р. brassicae проглатывали кристаллы.
Первоначальные представления о точной природе действия на эпителий средней кишки сводились к растворению вещества базальной мембраны, цементирующего клетки неким соединением, сходным с гиалуронидазой, содержащимся в кристалле. Нет никаких доказательств для этого, за исключением отделения клеток эпителия друг от друга. Скармливая гусеницам кристаллы и Na2C14O3 или U*С14-глюкозу, Фаст и Ангус доказали, что концентрация в гемолимфе ионов карбоната, меченного С14, повышалась быстрее, чем у контрольных гусениц, не получавших белковых кристаллов. Это указывает на повышение проницаемости стенки кишечника — первое биохимическое повреждение, вызываемое белковым токсином. Более важным было открытие, что содержание глюкозы в гемолимфе повышается медленнее, чем в контроле. Обычно глюкоза поступает в клетки кишечника благодаря активной транспортной системе в клеточной оболочке, и замедленное повышение ее концентрации в гемолимфе указывает, что эта метаболически регулируемая система повреждена.
Когда гусеницы В. mori поглощали листья, обработанные валиномицином, они поражались таким же образом, как гусеницы, поглощавшие кристаллы (табл. 16). Валиномицин повышает проницаемость оболочек митохондриев для калия. У гусениц бабочки-сатурнии Cecropia sp. средняя кишка является главным местом ионной регуляции, причем K+ перемещаются из полости тела в просвет кишечника в результате активного процесса. Нарушение регуляции K+ могло бы объяснить повреждение клеток, вызванное кристаллом.

Механизм действия и токсичность кристалла белкового токсина В. thuringiensis

В течение 1—7 ч после дачи корма с кристаллами pH крови гусениц В. mori повысился по сравнению с нормальным 6,8, а pH кишечника снизился одновременно с общим параличом тела. Инъекция нетоксичного щелочного буфера в полость тела насекомых, не получавших кристаллы, также вызывала паралич; это показывает, что паралич гусениц отравленных кристаллами, был вызван повышением pH крови. Рамакришнан показал, что уровень K+ в гемолимфе повысился в 5 раз после того, как гусениц В. mori кормили листьями, обработанными кристаллами, и предположил, что это повышение K+ в гемолимфе было причиной паралича. Кукси и др. показали, что только переваренный кристаллический белок блокировал нервную проводимость в препарате американского таракана Periplaneta americana (табл. 17). Тест-препаратами служили церкальный нерв и V и VI брюшные ганглии, выделенные из взрослых тараканов. Нервные волокна церкальных нервов соприкасались в синапсе с гигантскими нервными волокнами VI ганглия, так что для изучения синаисов можно было использовать стимуляцию церкального нерва и обнаружение эфферентной реакции соответствующего нервного тяжа, выше VI ганглия. Нарушение регуляции K+ в синапсе будет несомненно влиять на проводимость импульсов. Эти различные линии доказательств предполагают, что характер действия кристалла заключается в ослаблении проницаемости мембраны в результате нарушения регуляции ионов калия. Ho чтобы доказать эту теорию, нужно провести дополнительные исследования.
Механизм действия и токсичность кристалла белкового токсина В. thuringiensis

Применив иной подход, Фауст обнаружил, что растворенный кристаллический белок образовывал in vitro комплекс с белком с высокой изоэлектрической точкой. К этой категории относится несколько белков, важных для клеточного метаболизма, например цитохром С и триозофосфат и дегидрогеназа. При pH около 7 комплекс белок — белок осаждался и биологическая активность полученного из клеток белка маскировалась. Таким образом, кристаллический белок может подавлять важные функции клеток. Однако in vivo действующим началом кристалла является переваренный белок. Пока кристалл не будет полностью переварен в кишечнике, часть его существует свободно и могла бы подавлять ферменты в оболочках эпителиальных клеток. Проведение контрольного опыта повысило бы ценность этой работы. Реакция другого белка с низкой изоэлектрической точкой, например яичного альбумина, с ферментами, которые испытывал Фауст, показала бы, специфично ли образование комплекса. Кристаллический белок осаждает также белок гемолимфы, хотя это вряд ли связано с механизмом действия токсических молекул, освобождающихся в результате переваривания кристаллического белка.
При таком множестве физиологических изменений в насекомых действительно удачно, что кристалл не токсичен для млекопитающих. Одна из причин этого отсутствия токсичности заключается в том, что у млекопитающих первичное переваривание белков происходит при низком pH. Под действием пепсина, желудочного фермента, для которого оптимален pH 2, кристалл деградирует до нетоксичного состояния.
Кристалл В. thuringiensis чрезвычайно токсичен для гусениц бабочек (табл. 18). Кукси проводил испытания с одной и той же партией насекомых, поэтому цифры для растворенного белка и целых кристаллов вполне сравнимы. Из них видно, что методика растворения, как уже указывалось в разделе IV, А, должна в какой-то степени повреждать структуру кристаллического белка или понижать конечный выход активных токсических молекул, образующихся в результате протеолиза. На основании данных таблицы 17 нельзя решить, является ли белок, переваренный in vitro, более токсичным, чем целый кристалл.
Механизм действия и токсичность кристалла белкового токсина В. thuringiensis

Токсичность растворенных кристаллических белков (табл. 19) и чистых кристаллов из различных штаммов В. thuringiensis сильно колеблется в разных видах насекомых, из чего видно, что насекомые могут быть восприимчивы к разным токсическим компонентам кристалла. Возможно, разница в pH кишечника и содержании ферментов у видов насекомых влияют на выход одних и тех же токсических молекул. Даже неодинаковая скорость протеолиза в кишечниках двух насекомых может повлиять на скорость образования токсина из белка и, таким образом, на абсолютную концентрацию токсина в конкретное время. Кишечные белки Pieris лизируют кристаллы В. thuringiensis var. thuringiensis с большей легкостью, чем кристаллы В. thuringiensis var. entomocidus. Возможно, для того чтобы токсическая молекула приобрела биологическую активность, на ней должны иметься две или больше структуры или же для полной активности требуются два или больше отдельных пептидов. Разницу в токсичности кристаллов из различных штаммов бактерий для одного вида насекомого и различную токсичность кристалла одного и того же штамма бактерий для разных видов насекомых следует объяснять разницей в структуре кристаллов и различиями между видами насекомых.
Механизм действия и токсичность кристалла белкового токсина В. thuringiensis