07.11.2017
31.10.2017
21.10.2017
21.10.2017
21.10.2017
04.10.2017
04.10.2017
28.09.2017
01.09.2017
31.08.2017
Растворимость кристаллического белка токсина В. thuringiensis
 20.06.2014

Белки состоят из аминокислот, соединенных пептидной связью, откуда следует, что при изучении кристаллического белка следует начинать с анализа его аминокислотного состава (табл. 14). Необычных аминокислот обнаружено не было. Необходимо предположить, что аминокислоты были в их естественной L-форме, поскольку их конфигурация не была описана. Ничто в основной структуре белка не указывает на его токсические свойства. Некоторые свойства можно, однако, пояснить. Низкий показатель растворимости рК (при pH 4,4) обусловлен большим числом (около половины) дикарбоновых кислот, присутствующих не в форме амидов. Нерастворимость кристалла нельзя приписать большому числу серных (—S—S) мостиков в белке, поскольку содержание цистина в белке недостаточно высоко.
Утверждение Фауста и Эстеса, что они сумели объяснить нерастворимость кристалла, требует тщательного изучения. Они анализировали специально очищенные кристаллы трех штаммов В. thuringiensis и обнаружили в них присутствие 0,36% (по весу) кремния. Хотя это открытие еще должно быть подтверждено в литературе, предположение, что кристалл имеет каркас из кремния, дает очень удобное объяснение его нерастворимости.

Растворимость кристаллического белка токсина В. thuringiensis

Чтобы изучать строение кристаллического белка обычными методами химии белков, его необходимо растворить. Осуществить это очень нелегко. В описанных методах растворения результата достигают за счет химического изменения структуры кристаллического белка. Применение высоких pH и восстановителей для разрыва серных связей освобождает больше полипептидных цепей, чем их имелось в исходных кристаллах. Поскольку изучать нерастворимый белок невозможно, ученые в качестве отправной точки исследований должны использовать белок, даже если он фактически является артефактом. Особенно важно не разрушать углеродной связи (углерод—углерод) в процессе растворения, и поэтому следует применять только самые щадящие методы. При изучении белка как токсина нужно выбирать методы, сохраняющие также и токсичность.
Ангус изучал процесс растворения белковых кристаллов в щелочных буферах, затем Лекадэ показала влияние концентрации восстановителей на скорость растворения. Она измеряла эту скорость по снижению мутности суспензии кристаллов. Одним из самых убедительных аспектов этой работы, показавшей роль восстановителей, было ингибирующее действие цистина — дисульфида цистеина — на скорость растворения кристаллического белка. Лекадэ использовала также мочевину, реагент, денатурирующий белок и, как известно, эффективно «развертывающий» вторичную структуру белка в результате разрушения водородных связей. Андерсон и Рогов использовали мочевину в присутствии бороводорода натрия; этот метод не рекомендуется в связи с риском разрушения пептидных связей. Кристаллы полностью не растворялись даже в присутствии высоких (0,1 м) концентраций восстановителей при нейтральном pH.
Дисковый электрофорез дает в основном качественное представление о молекулах, имеющихся в растворах кристалла. Картины, получаемые при растворении кристалла в буферах с высоким pH (до pH 12), не имеют принципиальных отличий от получаемых при более мягких растворителях (pH 9,5, β-меркаптоэтанол, мочевина). Сходный растворитель использовали также Делафилд и др. Однако при высоком pH происходили количественные потери токсической фракции (табл. 15).
Растворимость кристаллического белка токсина В. thuringiensis

Систематическое изучение условий растворения путем количественных испытаний методом радиальной иммунодиффузии показало, что, хотя мочевина и необходима для полного растворения кристаллического белка, без мочевины достигалась более высокая удельная активность токсина (т. е. число токсичных единиц на 1 мг белка). Карбонатный (0,05 М) буфер с pH 9,5, содержащий 0,05 M β-меркаптоэтанола, был выбран в качестве растворителя для стандартных определений после исследования буферов с pH от 8 до 9,5, буферных ионов tris-гидроксилметиламинометана (tris), бората, фосфата и карбоната; восстановителей, тиогликолата (меркаптоацетата), β-меркаптоэтанола, дитиотреитола; с мочевиной и без нее.