07.11.2017
31.10.2017
21.10.2017
21.10.2017
21.10.2017
04.10.2017
04.10.2017
28.09.2017
01.09.2017
31.08.2017
Строение кристалла токсина В. thuringiensis
 20.06.2014

Первые электронные микрофотографии, полученные Ханнеем, показали, что кристалл представляет собой бипирамиду, поверхность которой покрыта рельефными бороздками, отстоящими друг от друга примерно на 29 ммк. Когда была установлена известная уникальность этого белкового кристалла, естественно, возник интерес к его физической структуре. Изображения углеродных отпечатков поверхности кристалла, которые опубликовал Лабоу, выявили более детальную структуру поверхности, и это привело его к выводу, что основная белковая субъединица представляет собой шар с диаметром около 8,7 ммк. Холмс и Монро применили другой подход, исследовав кристалл методом рентгеноструктурного анализа, и на основании своих результатов заключили, что белковые субъединицы имели форму палочек или гантелей. Они утверждали, что их наблюдения можно согласовать с наблюдениями Лабоу, если допустить, что палочки обращены своими центрами к сильно уплотненному образованию, так что возникает четырехходовая винтовая симметрия. На рисунке 11 показана модель кристалла, сконструированная на основе данных рентгеноструктурного анализа в интерпретации Холмса и Монро. Из этой модели ясно, что поверхность кристалла должна иметь характерные черты и что срезы через кристалл, сделанные параллельно его длинной оси или параллельно основной плоскости, должны выявить характерное расположение субъединиц.

А. Внутренняя структура

Норрис получил электронные микрофотографии тонких срезов через кристаллы, как находящиеся внутри клеток, так и свободно лежащие вне их. Белковая субъединица представляла собой палочковидное тело размером примерно 4,7х11,8 ммк, и порядок расположения этих единиц соответствовал модели, построенной на основе данных рентгеноструктурного анализа (рис. 11).
Строение кристалла токсина В. thuringiensis

Б. Строение поверхности

Кристалл, особенно полностью сформировавшийся после освобождения из спорангия, слишком толст, чтобы в него мог проникнуть электронный луч в электронном микроскопе, и поэтому для выявления деталей строения поверхности кристалла требуются специальные методы. Превосходные снимки Лабоу свидетельствуют о высоком мастерстве, но метод углеродных реплик относительно груб, и, хотя результаты, полученные на этой стадии, представляли большую ценность, тем не менее детали были выявлены недостаточно для правильного суждения о них.
Одной из проблем электронно-микроскопического исследования поверхности кристалла является характер предварительной обработки. Усиленное отмывание кристалла безусловно приводит к эрозии поверхности, но без этого белок, адсорбированный из культуральных жидкостей, и продукты распада клеток могут маскировать детали поверхности. Поведение кристаллов из различных разновидностей несколько отлично, и наши представления о тонком строении поверхности кристалла получены путем анализа снимков разных кристаллов. Тем не менее имеется достаточно доказательств сходства основной структуры у различных разновидностей, и все применявшиеся методы были проверены на нескольких разновидностях.
Негативное окрашивание фосфовольфрамовой кислотой, часто используемое для выявления тончайших деталей биологических структур, казалось бы, сулило мало успеха в работе с крупными, непроницаемыми для электронов кристаллами, но фактически концы некоторых кристаллов достаточно проницаемы для электронов, и применение негативной окраски позволило получить ряд наиболее информативных снимков. К настоящему времени лучшие изображения, окрашенные негативным методом, были получены при использовании кристаллов В. thuringiensis var. finitimus. Здесь, возможно, имеет значение то, что эти кристаллы образуются внутри экзоспоры развивающейся споры, и эта тонкая мембрана защищает поверхность от маскировки или эрозии. Сходные, но менее четкие структуры отмечены на поверхности кристаллов других разновидностей.
Негативное окрашивание — нелегкий метод, поэтому нужно практиковаться достаточно продолжительное время, прежде чем отказываться от него как от непродуктивного. Для исследования кристаллов В. thuringiensis свежесобранных бактерий (предпочтительно выращенных на твердых средах) промывают в буферном растворе и суспендируют в дистиллированной воде. Затем суспензию оставляют высыхать на сетках электронного микроскопа, покрытых формваром, окрашивают в течение 15 с 2%-ной фосфовольфрамавой кислотой в воде при pH 7 и оставляют для просушки на воздухе. В электронном микроскопе препараты быстро портятся, поэтому снимки нужно делать возможно быстрее, после того как сетка будет введена в микроскоп.
Наилучшую информацию о строении поверхности кристалла позволит, вероятно, получать недавно разработанный метод выявления структуры в замороженном состоянии. Его преимущество в том, что свежий материал быстро замораживается в самом начале и поэтому почти совсем не получает искажений, обусловленных фиксацией или сушкой.
Электронные микрофотографии редко удается легко интерпретировать. Даже при самых деликатных методах подготовки препарата биологический материал подвергается относительно грубому воздействию, в связи с чем артефакты обычны и иногда коварны. При увеличениях электронного микроскопа обнаруживаются структуры, которые нелегко проверить иными способами, поэтому при подготовке материала для исследования тонкого строения очень важно использовать возможно больше разных методов. Это, в частности, относится к изучению тонких структур типа кристаллов В. thuringiensis. Сравнение ряда снимков со строением модели, изображенной на рисунке 11, свидетельствует о большом сходстве строения поверхностей кристалла и модели. В настоящее время данные электронной микроскопии еще не настолько основательны, чтобы безусловно принять модель структуры, описанную Холмсом и Монро, но совершенно ясно, что если структура кристалла и не вполне идентична постулированной модели, то определенно очень близка к ней. Если субъединица, показанная на одном из снимков Соммервилла, действительно является основной белковой субъединицей кристалла, то ее можно описать как структуру в форме гантелей размером примерно 5х15,5 ммк. С учетом сжатия, вызываемого фиксацией и заливкой для микротомных срезов, эти размеры соответствуют размерам палочковидной субъединицы, видимой на тонких срезах.