Рост В. thuringiensis
20.06.2014
На средах точно известного состава, содержащих глюкозу и соли, В. thuringiensis растет только медленно и спорулирует слабо. Рост можно усилить добавлением аминокислот или гидролизата казеина, но если не сбалансировать содержание азота в среде с соответствующим источником углерода и энергии, таким, как глюкоза, то споруляция по-прежнему будет слабой. Некоторые исследования касались влияния различного аминокислотного состава питательных сред на рост В. thuringiensis. Так, присутствие лейцина или изолейцина вызывает задержку роста, которая устраняется валином. Добавление только треонина или серина также оказывает ингибирующее действие, но смесь обеих этих аминокислот такого действия не оказывает, а торможение роста сери-ном можно устранить метионином. Объяснения этим влияниям не было дано, и имеющиеся наблюдения расходятся с тем, чего можно было ожидать от уже известных механизмов регуляции роста.
Большинство исследований метаболизма В. thuringiensis проведено на различных формах простых сред с неполностью известным составом. Особенно пригодной для этих работ оказалась среда, содержащая 0,1% глюкозы, 0,2% экстракта дрожжей, 0,2% (NH4)2SO4, 0,05% К2НРО4 и минеральные соли. В течение экспоненциальной фазы роста на среде этого типа глюкоза используется и накапливаются уксусная и пировиноградная кислоты, которые понижают pH примерно до 5. Позднее уксусная кислота преобразуется при метаболизме, и примерно через 2—3 ч pH снова повышается до нейтрального уровня. Факторы, препятствующие обмену ацетата, предупреждают споруляцию В. thuringiensis, а также ингибируют синтез кристалла. Примером служит фтор-ацетат, который может предупреждать обмен ацетата, подавляя активность аконитатгидратазы, и является эффективным ингибитором образования спор и кристаллов. В присутствии этого ингибитора ацетат продолжает накапливаться в течение экспоненциальной фазы роста и pH не повышается. Другим ингибитором образования спор и кристаллов у В. thuringiensis является α-пиколиновая кислота.
Эритромицин в концентрациях, слишком низких для подавления роста бактерий, мешает образованию зрелых спор, но не препятствует нормальному формированию кристалла. В присутствии антибиотика спорангии не распадаются, и кристаллы сохраняются в остатках клеточных оболочек.
Синтез экзоцеллюлярного протеолитического фермента — одно из самых первых явлений, связанных с началом споруляции, и появление этого фермента обязательно для успешного завершения процесса. Мутанты, неспособные вырабатывать протеазу, не образуют ни спор, ни кристаллов. Имеется достаточно доказательств широких превращений белка вегетативных клеток, способствующих синтезу спор и кристаллов. Монро первый доказал, что белки, антигенно близкие к кристаллическим белкам, в экстрактах вегетативных клеток не появляются до тех пор, пока под электронным микроскопом не обнаруживают кристаллы. Он доказал также, что меченые аминокислоты, добавляемые во время споруляции, включаются в состав кристаллических белков. Если меченый глутамат добавляют во время вегетативного роста или позднее, в период формирования кристалла, то метчик появляется в тех же самых пептидах кристаллического белка независимо от времени, когда аминокислота была добавлена к среде.
Хотя среды определенного и не полностью известного химического состава играют важную роль в исследованиях метаболизма растущих культур В. thuringiensis, но промышленное производство спор и кристаллов для использования в качестве инсектицидов требует более дешевых сред для глубинных ферментаций, применимых для выращивания В. thuringiensis. Среды на основе таких дешевых субстратов, как патока, кукурузный экстракт, рыбная мука и соя, обеспечивали пышный рост и споруляцию микроорганизма. Размер кристаллов, образующихся в отдельных клетках, несколько колебался на разных средах. Одна из сред, успешно используемых для глубинной ферментации, содержит 2% рыбной муки, 1% крахмала, 0,1% CaCO3, 0,001% ниацина и смесь солей. Такие среды используются обычно в ферментационных чанах емкостью в тысячи литров. Оптимальная температура для роста В. thuringiensis около 30 °С, и для интенсивной споруляции на всех стадиях развития культуры необходима хорошая аэрация. Понижение температуры ниже 15 °C может привести к задержке образования спор, хотя формирование кристаллов может продолжаться.
