07.11.2017
31.10.2017
21.10.2017
21.10.2017
21.10.2017
04.10.2017
04.10.2017
28.09.2017
01.09.2017
31.08.2017
Протеазы
 20.06.2014

Протеазы, например гидролазы пептидных связей, вырабатываются многими видами бактерий из многих родов. Другие микроорганизмы, особенно грибы, также образуют значительные количества данных ферментов, и это их свойство используется в промышленной микробиологии. Примерами выдающихся продуцентов экстрацеллюлярных протеаз служат Pseudomonas aeruginosa, Proteus vulgaris, Serratia marcescens, некоторые бациллы, энтерококки, виды клостридий и др. Многие из них образуют эластазы и коллагеназы, которые с биохимической точки зрения можно считать протеазами.
В 1960 г. Бухер указал, что протеаза В. thuringiensis может участвовать в патогенезе, поскольку после проникновения бактерии в полость тела фермент способен разрушать фагоциты. Это предположение было основано скорее на умозрительных заключениях, чем на фактах. Он считал также, что виды бактерий, отличающиеся высокой протеолитической активностью, установленной при их выращивании на желатиновой среде, при инъекции в полость тела более вирулентны, чем другие. Ho все подобные утверждения не были подтверждены точными экспериментальными данными.
Когда изучался механизм патогенности P. aeruginosa, эта бактерия иногда оказывалась патогенной для личинок различных насекомых; утверждалось, что также и в полевых опытах она важный факультативный патоген. Она вырабатывала внеклеточно соединение, токсичное при инъекции в полость тела вощинной огневки, Galleria mellonella. Считалось, что это соединение представляет собой белок, что в сочетании с его антигенными свойствами и влиянием на потребление кислорода гусеницами огневки позволило отнести его к внеклеточным токсическим антигенам со всеми признаками экзотоксина. Позднее после выделения оказалось, что эта протеаза более токсичная, чем протеаза Bacillus subtilis. Даже если протеолитическая активность обеих протеаз на контрольном субстрате in vitro была одинаковой, то их токсическая активность in vivo была различной, из чего видно, что протеаза P. aeruginosa обладала специфическим сродством к белкам гусениц вощинной огневки. Это повлекло за собой детальное изучение данной модельной системы.
Условия, при которых образовывался фермент, и его свойства были описаны. Из фильтрата культуры используемого штамма методами хроматографии на колонке DEAE-целлюлозы, гельфильтрации и дискового электрофореза было выделено пять различных протеолитических фракций. Молекулярные веса и оптимальные pH показывают, что четыре из них, вероятнее всего, представляют собой мономер и соответствующие олигомеры того же фермента. С другой стороны, токсичность этих фракций для гусениц вощинной огневки была неодинакова. Наиболее токсичной оказалась фракция с молекулярным весом 26 000. Ферментативное ингибирование привело к пропорциональному снижению токсичности, и, таким образом, удалось установить достаточно высокую корреляцию между протеолитической активностью и токсичностью.
Поскольку теоретически токсины могут нарушать функцию или повреждать структуру, дальнейшие исследования были сосредоточены на изменениях в гемолимфе после ее обработки ферментами. При изучении энзиматической кинетики фермента с использованием гемолимфы в качестве субстрата возникло подозрение, что фермент действует не на все белки (протеины) гемолимфы. Дисковый электрофорез показал, что фермент действовал только на две из 18 белковых полос. Это подтвердил и электрофорез гемолимфы гусениц, обработанной ферментами in vivo. Дальнейшее исследование концевых аминокислот в белках гемолимфы гусеницы, переваренных ферментом, показало, что фермент расщепляет in vitro те же самые пептидные связи в некоторых белках гемолимфы, которые он расщепляет в синтетических пептидах (неопубликованные данные Кучеры и Лысенко).
Хотя это исследование еще не окончено, из него уже можно сделать некоторые выводы. Протеаза P. aeruginosa токсична для гусениц вощинной огневки при инъекции; в этом отношении она напоминает каппа- и лямбда-токсины Clostridium welchii. Различные протеазы, вырабатываемые разными организмами (бактериями, грибами, растениями и животными), неодинаково токсичны для гусениц вощинной огневки (рис. 8). Эти опыты показывают, что механизмы действия этих токсичных ферментов связаны с гемолимфой насекомых, но природа механизма все еще неясна. Здесь возможны два объяснения: смерть вызывается или 1) исчезновением белков в результате их чувствительности к действию фермента, или 2) продуктами распада, освобождаемыми из этих белков. Является ли причина гибели прямой или косвенной, сказать трудно. С другой стороны, не исключено наличие основного или параллельного воздействия на функции лимфоцитов или на другую чувствительную структуру. Тем не менее токсичность для гусениц вощинной огневки может отличаться от токсичности для других видов насекомых. Например, восприимчивость гусениц 5-го возраста Mamestra brassicae более чем в 100 раз превышает восприимчивость гусениц вощинной огневки (неопубликованные данные Лысенко и Кучеры).

Протеазы