18.04.2024 15.04.2024 15.04.2024
|
Фиксаторы при определении патогенов 20.06.2014
Цель фиксации заключается в сохранении физического строения живых систем и подготовке их для химической обработки, которая должна помочь изучению структуры с помощью светового или электронного микроскопов. Кроме того, путем фиксации можно сохранить природу и расположение химических компонентов, характеризующих жизненные процессы. На выбор материалов и методов фиксации оказывает влияние природа организмов и структур, подлежащих исследованию. 1. Высокая температура Бактериальные мазки, высушенные на воздухе, можно фиксировать, быстро проведя стекло 5—6 раз сквозь пламя бунзеновской горелки. Мазки нужно немедленно окрашивать, например, по Граму. 2. Метиловый спирт Высушенный мазок заливают тонким слоем спирта и дают высохнуть перед окрашиванием раствором Гимза. 3. Формалин Гистологические срезы выдерживают в 4%-ном водном растворе в течение 12 ч или дольше. Цельные экземпляры (например, личинки комара) выдерживают в 7%-ном водном растворе в течение 24 ч или дольше. Нейтральный раствор (pH 7,0) используется в качестве фиксатора в случае крайней необходимости подготовки ткани для электронной микроскопии, когда нет других химических фиксаторов. 4. Фиксатор Цинкера К 100 мл H2O добавляют: двухромовокислого калия 2,5 г, сернокислого натрия 1,0 г, хлористой ртути 5,0 г. Перед употреблением добавить 5 мл 80%-ной уксусной кислоты. Кусочки ткани не толще 3—4 мм фиксируют 12—24 ч и перед дальнейшей обработкой промывают 2 ч в проточной воде. Для удаления осадков можно несколько минут промывать ткань в растворе Люголя. 5. Водный раствор фиксатора Буэна Берут насыщенного водного раствора пикриновой кислоты 75 мл, формалина (40%-ный раствор) 25 мл, ледяной уксусной кислоты 5 мл. Фиксируют 12—24 ч или хранят материал в фиксаторе. Перед дальнейшей обработкой промывают 4—б ч в воде для удаления фиксатора. 6. Спиртовый растор Буэна (фиксатор Буэна-Дюбоска) Берут этилового спирта (80%) 150 мл, формалина (40°-ный раствор) 60 мл, ледяной уксусной кислоты 15 мл, кристаллов пикриновой кислоты 1 г. Фиксируют 1—3 дня. Образцы можно переносить из фиксатора непосредственно в 95%-ный этанол для дальнейшей обработки или в 70%-ный этанол для неограниченно долгого хранения. 7. Глутаровый альдегид - четырехокись осмия В интересах связности изложения методы фиксации и заливки материала для электронной микроскопии описываются совместно, в одном разделе. Химикаты можно получить от фирмы Polysciences, Inc., Rydal, Пенсильвания, США. 1. Разрезают ткань, погруженную для фиксации в глутаровый альдегид, на кусочки не толще 1 мм в наибольшем измерении. 2. Фиксируют 2—4 ч в 5%-ном буферном растворе глутарового альдегида (19 мл 0,2 M одноосновного фосфата натрия, 81 мл 0,2 M двухосновного фосфата натрия, 60 мл дистиллированной воды, 40 мл 25%-ного раствора глутарового -альдегида). 3. В течение часа промывают ткань в буферном растворе (19 мл 0,2 M одноосновного фосфата натрия, 81 мл 0,2 M двухосновного фосфата натрия, 100 мл дистиллированной воды). 4. Фиксируют 6—8 ч в 1%-ном буферном растворе OsO4. (Следующие водные растворы следует смешивать непосредственно перед употреблением: 37,3 мл 2,26%-ной NaH2PO4*H2O, 7,7 мл 2,5%-ного NaOH, 5,0 мл 5,4%-ной глюкозы, 0,5 г кристаллической OsO4). 5. 5 мин промывают ткань в дистиллированной воде, затем последовательно проводят ее через ряд растворов метилового спирта — 35, 50, 70, 80, 95%, выдерживая в каждом из них по 5 мин, и в абсолютном спирте—10 мин; под конец держат 30 мин в окиси пропилена. 6. Для приготовления срезов заливают ткань эпоксидной смолой (вестопал, аралдит) по следующей схеме: эпоксидная смола : окись пропилена (1:2)—1 ч; эпоксидная смола; окись пропилена (1:1)—1 ч; эпоксидная смола : окись пропилена (2:1)-1 ч. На ночь оставляют в чистой смоле. На следующий день разливают свежесмешанную заливочную среду в желатиновые капсулы и в каждую капсулу помещают по куску ткани. Заливочная среда состоит из 20 мл Эпона 812, 20 мл аралдита (эпоксидная смола 506), 60 мл ангидрида додеканилянтарной кислоты (смешать перед употреблением) и 2,0 мл ДМП 30 (диметилпиридина), добавляемого перед самым употреблением для ускорения затвердевания. 7. Капсулы выдерживают 3 дня при 74 °C. Затем их охлаждают в течение часа. Затвердевшие капсулы опускают в теплую воду для растворения желатина. Аккуратно обрезав края кубиков с залитыми тканями, готовят на ультрамикротоме срезы для электронной микроскопии. |