01.09.2017
31.08.2017
08.08.2017
14.07.2017
06.07.2017
19.06.2017
19.06.2017
19.06.2017
15.06.2017
12.06.2017
Фиксаторы при определении патогенов
 20.06.2014

Цель фиксации заключается в сохранении физического строения живых систем и подготовке их для химической обработки, которая должна помочь изучению структуры с помощью светового или электронного микроскопов. Кроме того, путем фиксации можно сохранить природу и расположение химических компонентов, характеризующих жизненные процессы. На выбор материалов и методов фиксации оказывает влияние природа организмов и структур, подлежащих исследованию.
Материал нужно фиксировать немедленно и быстрым способом, чтобы избежать порчи структур. Фиксация всех частей организма должна начинаться одновременно. Чтобы добиться большей четкости структуры, нужно подвергнуть действию фиксатора максимальную площадь поверхности образца и воздействием низкой температуры свести до минимума активность ферментов в клетках хозяина. Так, например, хорошая видимость субцеллюлярной структуры требует, чтобы отдельные клетки подверглись после тончайшего измельчения ткани действию холодного химического фиксатора, а затем были обработаны в ледяной бане. И наоборот, щетинки на поверхности личинки комара можно легко различить на экземпляре, убитом и фиксированном любым консервирующим средством.
Общедоступным фиксатором является формалин, который очень просто приготовляется. Цельные насекомые или ткани, фиксированные и хранящиеся в формалине, не портятся во время хранения или пересылки, поскольку ткани затвердевают. Воздействие высоких тропических температур или сапрофитных организмов не угрожает качеству образцов. Ho, с другой стороны, для образцов, фиксированных формалином, характерны искажение структуры и усадку ткани. Поэтому определять строение ткани, степень и методику окрашивания тканей, фиксированных формалином, труднее, чем после фиксации тканей растворами Буэна или Ценкера. Последний фиксатор пригоден для мелких образцов, не «крупнее 3—4 мм, которые требуется быстро подготовить для гистологических исследований. Растворы Буэна (спиртовой и водный) предназначены для фиксации и кратковременного хранения, с- последующим неограниченным сроком хранения образцов в 70%-ном спирте. Спиртовой раствор Буэна проникает в ткани лучше, чем водный, что сводит до минимума деформацию и усадку тканей. Максимальная разрешающая способность при пользовании электронным микроскопом достигается при фиксации образцов глутаровым альдегидом с четырехокисью осмия. Выбор фиксатора может определяться наличием реактивов и преобладающими условиями: при выборе метода навык в применении какого-либо конкретного из них может перевесить все другие соображения.

1. Высокая температура

Бактериальные мазки, высушенные на воздухе, можно фиксировать, быстро проведя стекло 5—6 раз сквозь пламя бунзеновской горелки. Мазки нужно немедленно окрашивать, например, по Граму.
2. Метиловый спирт

Высушенный мазок заливают тонким слоем спирта и дают высохнуть перед окрашиванием раствором Гимза.
3. Формалин

Гистологические срезы выдерживают в 4%-ном водном растворе в течение 12 ч или дольше. Цельные экземпляры (например, личинки комара) выдерживают в 7%-ном водном растворе в течение 24 ч или дольше. Нейтральный раствор (pH 7,0) используется в качестве фиксатора в случае крайней необходимости подготовки ткани для электронной микроскопии, когда нет других химических фиксаторов.
4. Фиксатор Цинкера

К 100 мл H2O добавляют: двухромовокислого калия 2,5 г, сернокислого натрия 1,0 г, хлористой ртути 5,0 г. Перед употреблением добавить 5 мл 80%-ной уксусной кислоты. Кусочки ткани не толще 3—4 мм фиксируют 12—24 ч и перед дальнейшей обработкой промывают 2 ч в проточной воде. Для удаления осадков можно несколько минут промывать ткань в растворе Люголя.
5. Водный раствор фиксатора Буэна

Берут насыщенного водного раствора пикриновой кислоты 75 мл, формалина (40%-ный раствор) 25 мл, ледяной уксусной кислоты 5 мл. Фиксируют 12—24 ч или хранят материал в фиксаторе. Перед дальнейшей обработкой промывают 4—б ч в воде для удаления фиксатора.
6. Спиртовый растор Буэна (фиксатор Буэна-Дюбоска)

Берут этилового спирта (80%) 150 мл, формалина (40°-ный раствор) 60 мл, ледяной уксусной кислоты 15 мл, кристаллов пикриновой кислоты 1 г. Фиксируют 1—3 дня. Образцы можно переносить из фиксатора непосредственно в 95%-ный этанол для дальнейшей обработки или в 70%-ный этанол для неограниченно долгого хранения.
7. Глутаровый альдегид - четырехокись осмия

В интересах связности изложения методы фиксации и заливки материала для электронной микроскопии описываются совместно, в одном разделе. Химикаты можно получить от фирмы Polysciences, Inc., Rydal, Пенсильвания, США.
1. Разрезают ткань, погруженную для фиксации в глутаровый альдегид, на кусочки не толще 1 мм в наибольшем измерении.
2. Фиксируют 2—4 ч в 5%-ном буферном растворе глутарового альдегида (19 мл 0,2 M одноосновного фосфата натрия, 81 мл 0,2 M двухосновного фосфата натрия, 60 мл дистиллированной воды, 40 мл 25%-ного раствора глутарового -альдегида).
3. В течение часа промывают ткань в буферном растворе (19 мл 0,2 M одноосновного фосфата натрия, 81 мл 0,2 M двухосновного фосфата натрия, 100 мл дистиллированной воды).
4. Фиксируют 6—8 ч в 1%-ном буферном растворе OsO4. (Следующие водные растворы следует смешивать непосредственно перед употреблением: 37,3 мл 2,26%-ной NaH2PO4*H2O, 7,7 мл 2,5%-ного NaOH, 5,0 мл 5,4%-ной глюкозы, 0,5 г кристаллической OsO4).
5. 5 мин промывают ткань в дистиллированной воде, затем последовательно проводят ее через ряд растворов метилового спирта — 35, 50, 70, 80, 95%, выдерживая в каждом из них по 5 мин, и в абсолютном спирте—10 мин; под конец держат 30 мин в окиси пропилена.
6. Для приготовления срезов заливают ткань эпоксидной смолой (вестопал, аралдит) по следующей схеме: эпоксидная смола : окись пропилена (1:2)—1 ч; эпоксидная смола; окись пропилена (1:1)—1 ч; эпоксидная смола : окись пропилена (2:1)-1 ч. На ночь оставляют в чистой смоле. На следующий день разливают свежесмешанную заливочную среду в желатиновые капсулы и в каждую капсулу помещают по куску ткани. Заливочная среда состоит из 20 мл Эпона 812, 20 мл аралдита (эпоксидная смола 506), 60 мл ангидрида додеканилянтарной кислоты (смешать перед употреблением) и 2,0 мл ДМП 30 (диметилпиридина), добавляемого перед самым употреблением для ускорения затвердевания.
7. Капсулы выдерживают 3 дня при 74 °C. Затем их охлаждают в течение часа. Затвердевшие капсулы опускают в теплую воду для растворения желатина. Аккуратно обрезав края кубиков с залитыми тканями, готовят на ультрамикротоме срезы для электронной микроскопии.