21.10.2017
21.10.2017
21.10.2017
04.10.2017
04.10.2017
28.09.2017
01.09.2017
31.08.2017
08.08.2017
14.07.2017
"Индуцированная" изменчивость микроорганизмов
 25.06.2014

Направленные изменения у микроорганизмов можно получать также методом индуцирования или «наведения» свойств. Суть этого метода состоит в том, что при совместном пребывании двух определенных видов некоторые их признаки и свойства передаются от одного вида к другому. Эти признаки передаются и при выращивании культуры в среде, содержащей продукты метаболизма или фильтраты другой культуры. Одному организму прививаются свойства другого.
Такие изменения впервые были отмечены у неспороносной палочки — Bact. proteus Зильбером, получившим параагглютинирующий вариант протеуса под влиянием тифозной палочки. Грачева получила у кишечной палочки — Bact. coli штамм со свойствами другого вида той же группы Bact. breslau. Прохоров этим же способом превратил кишечную палочку в культуру со свойствами возбудителя мышиного тифа. Тимаков со своими сотрудниками на протяжении ряда лет изучал индуцированную изменчивость у разных бактерий кишечной группы. Культуре Bact. coli он прививал свойства паратифозных (типа Бреслау и Шотмюллера), брюшнотифозных и дизентерийных бактерий, выращивая ее в среде с убитыми нагреванием культурами этих видов. Он предложил называть культуру, которой прививаются свойства, — «воспринимающей», а ту, свойства которой передаются, — «направляющей». О передаче антигенных свойств от одной культуры к другой накопилось много данных. Методом индукции получены варианты у разных представителей бактерий. Кроме бактерий кишечной группы индуцированию подвергаются стафилококки, многие неспороносные и спороносные бактерии, микобактерии и др. Легру и Женевре превратили непигментированный, авирулентный штамм Ps. руосуаnеа в пигментированную, вирулентную культуру. Превращение бесцветных, нефлюоресцирующих штаммов в пигментированные, флюоресцирующие культуры мы наблюдали у Ps. fluorescens, выделенного из ризосферы некоторых растений. Бесцветные штаммы выращивались или только сохранялись в среде с фильтратами флюоресцирующих бактерий. Спустя некоторое время при рассевах получались единичные колонии с хорошо выраженными свойствами наводящей культуры.
Александер и Лейди отмечают изменение этим методом гладких S- и бугристых R-форм у патогенной палочки — Bact. influenzae.
Аналогичные превращения отмечаются у спороносных бактерий. Мэннингер и Ногрэди выдерживали вирулентную, капсулированную, неподвижную культуру сибиреязвенного бацилла — Вас. anthracis в фильтрате сапрофитного, некапсулированного, подвижного почвенного бацилла — Вас. mesentericus и получили варианты, которые отличались от исходной культуры признаками, свойственными Вас. mesentericus. Эти новые варианты оказались некапсулированными, со жгутиками, подвижными и авирулентными. Томчик не подтвердил полностью эти данные, но в то же время отмечал, что бескапсульные варианты Вас. anthracis обладали антигеном, одинаковым с антигеном направляющей культуры — Вас. mesentericus.
Наведение свойств этим способом наблюдалось у менингококков, тифозных и паратифозных бактерий, у дезинтерийных палочек, у возбудителей дифтерии, микрококков и других представителей бактерий.
Мы сообщали данные своих исследований о прививке клубеньковым бактериям новых свойств вирулентности, т. е. способности образовывать клубеньки на корнях чуждых им бобовых растений.
Как известно, клубеньковые бактерии образуют клубеньки на корнях определенных растений. Например, клубеньковые бактерии сои способны образовывать клубеньки только на корнях сои, бактерии фасоли — на корнях фасоли, бактерии люпина — на корнях люпина и т. д. Соответственно этой специфике данные бактерии подразделяются на виды — Rhizoblum japonicum (sojae), Rh. phaseoli, Rh. lupini и т. д.
He все клубеньковые бактерии имеют столь строгую специфичность. Некоторые из них могут образовать клубеньки на корнях растений, принадлежащих к разным видам и даже разным близким родам. Например, Rh. leguminosarum образуют клубеньки на корнях гороха, вики, чечевицы, чины; Rh. meliloti — на корнях люцерны, медунки и пажитника. Следовательно, среди клубеньковых бактерий имеются виды, строго специализированные к одному только виду растений, и бактерии с групповой специфичностью.
Путем воспитания бактерий той и другой группы на средах с фильтратами бактерий направляющих культур нам удалось изменить специфичность их и привить свойства вирулентности направляющей культуры. Клубеньковые бактерии гороха, вики и донника приобрели способность образовывать клубеньки на корнях чуждых им растений — клевера, люцерны; бактерии акации начали образовывать клубеньки на корнях гороха и люпина, а бактерии конских бобов — на корнях фасоли и люцерны (табл. 4).

"Индуцированная" изменчивость микроорганизмов

He все клубеньковые бактерии удается изменить в указанном направлении и не все направляющие культуры способны передавать свою специфику другим видам бактерий.
Из девяти испытанных видов четыре не восприняли специфики наводящих культур. He воспринимают новые свойства многие культуры, принадлежащие к одному и тому же виду. Например, из двенадцати культур клубеньковых бактерий фасоли, выделенных из разных мест, семь не изменили своей специфики. Больше того, не все варианты, полученные экспериментально от одной и той же культуры, поддаются указанной изменчивости. Из двадцати вариантов клубеньковых бактерий клевера — Rh. trifolii более половины не восприняли вирулентности наводящей культуры, которой служил исходный штамм Rh. trifolii.
В последующих своих исследованиях нам удалось править свойства вирулентности некоторым неклубеньковым бактериям из рода Pseudomonas. При длительном выращивании этих бактерий на средах с фильтратами клубеньковых бактерий клевера и люцерны были получены штаммы, которые обладали способностью формировать клубеньки на корнях клевера или на корнях люцерны. Следует отметить, что таким изменениям подвергаются немногие культуры. Из 91 штамма разных видов и родов бактерий только два приобрели свойства направляющих культур, т. е. способность образовывать клубеньки на корнях бобовых растений.
Приобретенную вирулентность можно поддерживать неопределенно долгое время, путем пассажей с растения на растение. Вновь приобретенные признаки вирулентности часто не устраняют прежнюю специфику. Клубеньковые бактерии гороха, получив способность образовывать клубеньки на корнях клевера, не утратили способности образовывать их и на корнях гороха. То же отмечается и в отношении других вариантов бактерий, развивающихся на вике, акации, доннике, конских бобах.
Изменение свойств вирулентности у клубеньковых бактерий наблюдали Рубенчик и Петерсон. Под влиянием продуктов жизнедеятельности клубеньковых бактерий клевера были получены варианты у других видов Rhizobium со спецификой направляющей культуры.
Баласса изменял специфику вирулентности у клубеньковых бактерий путем воздействия на них дезоксирибонуклеиновой кислотой соответствующих культур Rhizobium. В качестве направляющей культуры он брал Rh. meliloti. Полученной от этой культуры дезоксирибонуклеиновой кислотой обрабатывались клубеньковые бактерии сои (Rh. japonicum) и люпина (Rh. lupini). После этого культуры испытывались на вирулентность к люцерне. Клубеньковые бактерии сои после воздействия указанным метаболитом Rh. meliloti приобретали способность образовывать клубеньки на корнях люцерны.
Как видно из изложенного, некоторые продукты метаболизма оказывают на воспринимающие их виды бактерий определенное действие, ведущее к изменению их признаков и свойств.
Особый интерес вызывают изменения, получаемые посредством «трансформации», описанной впервые Гриффитом. Этот автор установил, что у пневмококков типа III имеются вещества, которые могут передаваться при определенных условиях пневмококку типа II, сообщая ему свойства пневмококка типа III. Позже было показано, что эти превращения весьма специфичны и могут происходить не только в теле животных, но и в пробирках на соответствующих средах и при определенных условиях.
Вещество, вызывающее данные превращения, было выделено в химически чистом виде и хорошо изучено. Оказалось, что оно имеется только у пневмококка типа III (капсулированный, вирулентный тип) и воспринимается пневмококком типа II (непатогенный, бескапсульный). Химически очищенное вещество обладает большой трансформирующей силой. Достаточно добавить 0,003 μг этого вещества к 2 мл соответствующей среды, чтобы превратить авирулентную некапсулированную культуру пневмококка типа II в вирулентный капсулированный вариант пневмококка типа III. Химический, энзиматический, серологический анализ, а также данные, полученные путем электрофореза, ультрафиолетовой спектроскопии и др., показывают, что активная часть вещества не содержит ни белка, ни свободных липоидов или серологически активных полисахаридов. В основном эта часть состоит из дезоксирибонуклеиновой кислоты. Данная кислота вызывает синтез капсульного вещества. Исследования показывают, что дезоксирибонуклеат пневмококка S-варианта сходен с дезоксирибонуклеатами, полученными из других источников, например из культур бугристого R-варианта.
Ho действие их различно. Первый обладает трансформирующим свойством, переводит R-формы пневмококка в S-формы, а второй этим свойством не обладает. Следовательно, трансформирующее действие дезоксирибонуклеиновой кислоты, по-видимому, связано с присутствием ничтожных количеств других веществ, действие которых проявляется в присутствии указанного нуклеата.
He все пневмококки в состоянии воспринимать трансформирующее вещество. Из большого количества экспериментально полученных бескапсульных, авирулентных вариантов готовность восприятия вещества обнаруживается только у некоторых. Следовательно, активная часть капсульного вещества пневмококка типа III может быть эффективной только тогда, когда у воспринимающей культуры имеются специальные функционально активные акцепторы, определяющие биохимическую деятельность и специфический характер клеток пневмококков.
Аустриан и Мак-Леод обнаружили у пневмококков, кроме полисахаридной изменчивости, еще и белковую. По их наблюдениям, у пневмококков при их превращении меняется особый соматический белок. Вместе с указанным выше веществом этот белок в разных сочетаниях может давать в процессе изменчивости культуры разные варианты.
Хьюитт превращал некапсулированный авирулентный штамм палочки инфлюэнцы в капсулированный вирулентный. Хочкисс получил пенициллинустойчивые штаммы пневмококка из чувствительного путем выращивания последнего в среде с дезоксирибонуклеиновой кислотой, выделенной из клеток адаптированного к пенициллину штамма.
Стрептомицинчувствительные пневмококки, устойчивые к пенициллину, можно превратить в устойчивые к стрептомицину при помощи трансформирующего вещества, которое освобождается при лизисе стрептомицинустойчивых штаммов пневмококков под воздействием пенициллина. Это вещество, способное придавать культуре устойчивость к стрептомицину и передавать другие наследственные свойства от одного штамма к другому, относится не к дезоксирибонуклеиновой кислоте, а имеет иной химический состав. Оно не расщепляется ферментом дезоксирибонуклеазой. Такого же типа трансформирующее вещество превращает стрептомицинчувствительные штаммы мышиного тифа в стрептомицинустойчивые.
Явления трансформации описаны у некоторых неспороносных бактерий, имеющих слизистые капсулы. При воздействии соответствующих трансформирующих веществ они утрачивают капсулы, а вместе с этим и некоторые другие свойства или приобретают новые признаки.
По наблюдениям Циндера и Ледерберга, свойства клеток могут передаваться от одной культуры к другой при помощи особых мельчайших корпускул или частиц протопласта. Они вызывали специальным фагом лизис направляющей культуры. Продукты лизиса в виде указанных корпускул проходили через мелкопористый стеклянный ультрафильтр и поступали в клетки воспринимающей культуры. Последняя приобретала свойства первой. Зернышки — переносчики трансформирующего вещества очень мелки, не более 0,1 μ в поперечнике и видимы только в электронный микроскоп. Такой способ изменения культур авторы наблюдали у бактерий мышиного тифа — Bact. typhi murium. В опыте брались две культуры, различающиеся между собой потребностью в дополнительных веществах роста. Одна нуждалась в гистидине, а другая — в триптофане. Помещались они в один сосуд, разделенный стеклянным ультрафильтром, каждая в отдельную половину. В результате получались полноценные культуры. Подобный способ изменения культур был назван авторами трансдукцией.
Аналогичную картину изменения культур наблюдали Броун с сотрудниками у сибиреязвенного бацилла — Вас. anthracis.
В своих опытах они подобрали особый фаг (ламбда-фаг), который в отличие от многих других (всего было испытано 32 фага) обладал широким диапазоном действия. Он лизировал бактерии разных видов и родов: 9 шт. из рода Вас. anthracis, 3 шт. из рода Вас. cereus, 4 шт. Вас. cereus var. mysoides и др.
Этим фагом заражалась подвижная культура Вас. cereus, через сутки после инкубации она фильтровалась через ультрабактериальный фильтр, фильтратом или очищенным фагом этого фильтрата заражался неподвижный вирулентный штамм Вас. anthracis. По прошествии суток в культуре последнего появлялись подвижные палочки. От них была получена подвижная авирулентная культура с некоторыми свойствами Вас. cereus.
Авторы полагают, что фаговые элементы переносят определенные частицы живого вещества Вас. cereus в клетки сибиреязвенного бацилла и вместе с этим передают те или иные свойства. Такой характер изменчивости у названного бацилла, по данным авторов, закономерно проявляется во всех повторных опытах. Они считают, что наблюдаемый ими способ передачи свойств от одного организма к другому отличается от способа, описанного Циндером и Ледербергом. Последние утверждали, что переносчиком служили не фаговые частицы, а особые корпускулярные элементы.
Шпигельман при изучении индуцированной изменчивости у дрожжей получил вещество, которое вызывает способность сбраживать галактозу у видов, ранее не сбраживавших этот сахар. Вещество было им названо адаптином. Природа его остается невыясненной. Методом трансдукции удается прививать бактериям ферментативные антигенные, вирулентные и другие свойства, присущие направляющей культуре, а также получать подвижные штаммы от неподвижных, которым передается способность формировать жгутики через фаговые частицы.
К явлениям индуцированной изменчивости причисляются изменения, носящие название «рекомбинаций». Внешняя сторона этой изменчивости состоит в том, что при смешивании двух клеток различных культур образуются поколения со смешанными или комбинированными признаками исходных родительских организмов. Клетки передают свои свойства и признаки при непосредственном контакте друг с другом. Получаются новые варианты, которые называются перекомбинантами. Образование таких перекомбинантов описали Татум и Ледерберг у одного штамма кишечной палочки К-12. От него были получены дефектные варианты, утратившие способность синтезировать отдельные, необходимые для роста аминокислоты и витамины. С этими вариантами производились опыты «вегетативного скрещивания».
Кишечная палочка (штамм К-12) после облучения ультрафиолетовыми лучами образует штаммы, которые отличаются от исходной культуры неспособностью расти на простых синтетических средах без дополнительных веществ. Эти дефектные варианты называются ауксотрофами или минус-вариантами. Одни из них нуждаются в каком-либо одном дополнительном веществе: это моноауксотрофы, другие — в двух, трех и более веществах: это полиауксотрофы.
Если ауксотрофные штаммы выращивать каждый в отдельности на полноценной питательной среде и затем 10—15-часовые культуры после тщательной промывки в солевом растворе высеять на неполноценный питательный субстрат, то роста культур не наблюдается, посев будет стерильным. Только в редких случаях вырастают единичные колонии, новые варианты — протрофы, способные развиваться на средах без дополнительных ростовых веществ. Частота появления этих вариантов по подсчетам Ледерберга и других исследователей не превышает одной клетки на каждые 1000000 — 10000000 исходных ауксотрофов.
Наблюдения показывают, что и ауксотрофные варианты, будучи смешаны перед посевом, дают более интенсивный рост на неполноценной среде, чем это бывает в контрольных посевах.
Татум и Ледерберг, а также некоторые другие исследователи производили опыты в основном с двумя вариантами. Один из вариантов (58—161) требовал для своего роста биотин (Б-) и метионин (М-), другой — W-1177 — нуждался в треонине (Т-), лейцине (Л-) и витамине B1(B1-). Оба варианта не развивались без указанных веществ на специальных минимальных средах. При смешении этих вариантов были получены штаммы, которые отличались от исходных тем, что развивались на неполноценных средах, в отсутствие биотина и метионина, а также такие варианты, которые не нуждались в треонине, лейцине и витамине B1. Они сами синтезировали эти вещества роста. Схематически можно изобразить это так: штамм 58—161 (Б-М-) и штамм W-1177 (Т-Л-B1-) дают вариант Б + M + T + Л + B1 +.
Передача свойств при смешанных культурах может осуществляться разными штаммами. Тот или другой признак или свойство передается от клетки одного штамма клеткам другого штамма. Этот признак или свойство для простоты обозначается буквой F. Если признак имеется, клетки или вся культура обозначается своим названием с припиской F+. Если этот признак отсутствует, то культура имеет обозначение F-. Тот или иной признак может передаваться от одного штамма с F+ ко многим другим штаммам с F-. Например, по Хайесу, штамм или, как он называет, мутант №-677 (-CA) (стрептомицин и азид резистентный) при совместном пребывании с культурой 58-161 /F+ приобретает свойства последнего и превращается в штамм W-677 CA /F+. Число таких превращений в высевах на чашки с агаризованной средой достигает 75% отсеянных и испытанных колоний. Полноценный штамм, или культура 58—161 F+ передает фактор F+ неполноценным штаммам W-677/CA / /F-, 58—161 /F~, W-677/F-, 58—161/СА IF-. При этом получаются новые штаммы, полноценные и довольно стойко сохраняющие приобретенные свойства в течение нескольких месяцев пребывания на питательном яичном агаре Дорсета при 4°.
Фактор F, определяющий тот или иной признак, не передается через фильтраты. Молодая бульонная культура 58—161/F+ фильтровалась через коллоидный фильтр с порами 0,74 μ А. Р. Д. Неполноценный штамм W-677/F- выдерживался в фильтрате, после чего при рассеве на агаризованную среду отсевались колонии. Из 115 отсеянных колоний ни в одном случае не наблюдалось приобретения свойств направляющей культуры с F+.
Как уже отмечалось ранее, при смешении культур с отрицательным значением F- получается стерильность посева; при смешении культуры F+ с культурой F- посевы обладают большей продуктивностью. Например, в посеве вариантов 58—161 F+ и W-677 F- было получено 97 колоний протрофов из общего числа 945 млн. клеток ауксотрофов; при посеве штаммов 58—161 F+ и W-677 F+ протрофов насчитывалось всего лишь 4 колонии из общего числа в 477 млн., а в высеве штаммов 58—161 F-и W-677 F+ протрофов было 49 из 450 млн.
Как видно из приведенных данных, наибольшее число протрофов получается при посевах вариантов F+ с вариантами F-.
Неполноценные варианты кишечной палочки в опытах Хайеса были таковы: 58—161 нуждался в метионине и биотине (М-В-), ферментировал лактозу, мальтозу, маннит, галактозу, ксилозу и арабинозу, был чувствителен к колифагу T1 и резистентен к фагу T3. Варианты №-677 требовали для роста треонин, лейцин и тиамин (T-Л-B1-), не сбраживали лактозу, мальтозу, маннит, галактозу, ксилозу и арабинозу, к фагу T1 были резистентны, а к фагу T3 — чувствительны.
Кроме того, эти варианты по данным Маккакаро отличаются друг от друга некоторыми другими свойствами: отношением к кислотности среды, способностью поглощать краски и др.
В опытах других исследователей с кишечной палочкой К-12 получены аналогичные результаты. Дефектные штаммы, утратившие способность синтезировать ту или иную аминокислоту или витамин, приобретают ее снова при контакте с клетками, обладающими данными свойствами. Штамм У-24 в опыте Кларка, нуждающийся в биотине, фенилаланине и цистине (Б-Ф-Ц-), не растет на синтетической среде без этих веществ; штамм У-10 образует биотин, фенилаланин и цистин, но не образует треонина, лейцина и тиамина (T-Л-B1-) и не развивается на синтетической среде без этих соединений. После смешения таких двух организмов получаются штаммы, которые хорошо растут на указанных средах и синтезируют недостающие у исходных культур вещества роста.
Сермонти и Спада-Сермонти описали образование рекомбинантов при скрещивании штаммов синих актиномицетов — A. coelicolor, полученных после облучения ультрафиолетовыми лучами. Один штамм (5 me-hist-) нуждается в метионине и гистидине и образует синий пигмент; другой неполноценный штамм (14 pr.-glu-pigm.-) нуждается в пролине и глютаминовой кислоте, пигмента не образует. При смешанных посевах на агаризованные полноценные среды получаются колонии трех типов — исходные: а) 5 me-hist-, б) 14 pr.-glu-pigm.- и в) рекомбинанты — полноценные культуры, не нуждающиеся ни в метионине, ни в гистидине, ни в пролине, ни в глютаминовой кислоте.
Рицки отмечает передачу этим же способом свойства продуцировать пигменты у Bact. prodigiosum. Воздействуя на лейкорасу данного вида бактерий пигментированной культурой, автор обнаружил, что первая культура приобрела способность образовывать пигмент продигиозин.
Некоторые исследователи находили подобную передачу наследственных свойств у пневмококков, у бактерий мышиного тифа и др.
Кларк при изучении процесса образования рекомбинантов, установил, что он связан с плеоморфизмом культуры. Как правило, внешние воздействия, вызывающие дегенеративное развитие ауксотрофной культуры с образованием деформированных гигантских и прочих клеток, снижают число образования протрофов. Гаас и др. отмечают наличие корреляции между образованием сильно увеличенных, нитевидных и прочих полиморфных клеток и увеличением числа протрофных вариантов у ауксотрофов. По их наблюдениям, ультрафиолетовые лучи усиливают процесс рекомбинации у кишечной палочки с одновременным увеличением полиморфизма культуры. Некоторые химические вещества — перекись водорода и др. стимулируют образование протрофов. Григ придает большое значение зависимости появления рекомбинантов у ауксотрофов от количественного соотношения родительских исходных клеток в смеси.
Если в смеси скрещиваемых штаммов преобладают клетки со значением F+, то все клетки F- приобретают свойства F+. В тех случаях, когда в смеси тех и других клеток имеется поровну, перекомбинантов будет меньше. В случаях обратного соотношения, т. е. когда клеток F+ меньше, чем клеток F-, число превращенных F- в F+ будет наименьшим (табл. 5).
"Индуцированная" изменчивость микроорганизмов

Как видно из этих данных, при соотношении F- : F+, равном 1 : 25, из 20 испытанных клеток (колоний) все оказались вариантами, перерожденными из F- в F+; при соотношении тех же штаммов 1 : 1 число перерожденных вариантов оказалось равным 10 на 20 исследованных, а при соотношении 4:1 — равным 2 из 20 исследованных. Эти количества вариантов получаются через полчаса после смешения; через один час число их значительно меньше и еще меньшим оно оказывается через два часа. Ультрафиолетовые лучи усиливают плодовитость клеток F+, но не F- и ускоряют созревание профага в фаг, вследствие чего увеличивается число переносчиков генов.
При образовании вариантов перекомбинантов наблюдается такая закономерность: варианты Б+М+ (не нуждающиеся в биотине и метионине) образуются чаще, чем варианты Б-M+ (нуждающиеся в биотине). В посеве смеси количество их достигает 14%. Варианты с признаками B1+Л+ (образующие витамин B1 и лецитин) обнаруживаются чаще, чем варианты B1-Л+ или B1+Л-. Варианты с признаками T-Б+M+B1+Л+ (нуждающиеся в трионине) получаются чаще, чем варианты с признаками Т+Б+M+B1+Л+. Все эти данные показывают, что в живом веществе организма между признаками существует тесная связь.
Следует отметить, что подобные варианты при смешанных перекрестных посевах удается получить не у всех культур. Даже у одного и того же вида кишечной палочки только штамм К-12 дает варианты, способные к комбинированной изменчивости. Другой такой же штамм кишечной палочки (штамм В) не дает подобных вариантов. Многократные попытки получить от него варианты, которые давали бы перекомбинанты, были безуспешны.
Высказывается предположение, что штамм К-12 — гомоталлическая культура, а штамм В — гетероталлическая. Первый содержит в себе обе тенденции, мужскую и женскую, тогда как второй — только одну из них. Поэтому последняя по данному признаку не может расщепляться и давать при смешивании комбинированные варианты, как это имеет место у штаммов К-12. Штамм В однополый или асексуальный подобен некоторым несовершенным грибам, например, из группы аспорогенных дрожжей — Torulopsis, Mycotorula и др. При контакте минус вариантов гомоталлической культуры, по мнению авторов, происходит процесс слияния или обмена веществ между ними, напоминающий половой процесс у высших организмов. С этими веществами передаются и носители наследственных свойств, гены.
О механизме изменчивости. Как видно из изложенного, явление изменчивости у микроорганизмов весьма разнообразно как по своему проявлению, так и по характеру реакции на внешние воздействия. Механизм изменчивости и наследования признаков остается невыясненным. Высказываются разные точки зрения и предположения, которые можно свести к двум основным — теории мутации и теории физиологического приспособления. Эти теории высказывались давно, еще со времен первых открытий изменчивости у микробов вообще. Однако не было достаточных фактических данных, подтверждающих какую-либо из теорий.
Большой интерес представляют исследования последних лет в области изменчивости. Татум с сотрудниками показал, что некоторые приобретенные ферментативные свойства у отдельных вариантов гриба Neurospora передаются закономерно по наследству при половом воспроизведении подобно тому, как это имеет место у высших растений. После этих наблюдений были получены аналогичные данные у дрожжей рода Saccharomyces, Saccharomycodes и др. Клетки гаметы двух скрещиваемых культур соединяются между собой и образуют одну зиготу со свойствами родительских организмов. При последующем размножении зиготы признаки исходных культур расщепляются в поколениях, комбинируясь в различных сочетаниях. Образуются в результате новые варианты с комбинированными признаками. Эти варианты носят название комбинантов или рекомбинантов.
Такого типа изменчивость имеет место в эволюции микроорганизмов. Однако она возможна только у видов, размножающихся половым путем, У бактерий, актиномицетов, а равно у большого числа грибов (несовершенных) и дрожжей половой процесс в полном его проявлении отсутствует. Естественно, что у таких организмов изменчивость по типу полового смешения признаков не может наблюдаться и проводить здесь какой-либо генетический анализ нельзя.
Выше приведены данные, которые показывают, что у бактерий и других микробов могут происходить наследственные изменения, имеющие определенное сходство с генетическими изменениями типа комбинаций и рекомбинаций, свойственных дрожжам. Сторонники генной мутации допускают наличие у бактерий настоящих ядер с определенным набором хромосом и геноподобных структур, определяющих закономерности процесса изменчивости. В доказательство своих предположений исследователи приводят наблюдения Татума и его сотрудников над изменениями у вариантов кишечной палочки К-12 при перекрестном контакте клеток с различными свойствами. Полученные рекомбинации идентифицируются с комбинациями, получаемыми у грибов и дрожжей при половом скрещивании.
Само явление действительно напоминает комбинации, образуемые при половом воспроизведении, однако механизм здесь, по-видимому, иной. У названных бактерий нет полового процесса в той форме, какая наблюдается у грибов и дрожжей. Прямое слияние и перемешивание живого вещества двух клеток здесь невозможно. Надо полагать, что при контакте клеток в описанных выше случаях трансдукции трансформирующее вещество переходит из одной клетки в другую через ненарушенные оболочки, а если имеются нарушения последних, то они внешне не выявляются.
Наличие трансформирующих веществ в настоящее время можно считать установленным. Оно обнаруживается у разных микроорганизмов — бактерий, актиномицетов, дрожжей, грибов. Как отмечалось выше, оно найдено у пневмококков, неспороносных бактерий, у спороносных и др. В отдельных случаях установлено химическое строение этих веществ или выявлен их химический состав.
При трансдукции трансформирующее вещество может переноситься из клетки в клетку при помощи фагов. Последние строят свое тело из живого вещества клеток бактерий (в основном из дезоксирибонуклеиновой кислоты). Когда клетки лизируются, фаги освобождаются и, если переходят на клетки другой культуры, по-видимому, переносят к ним частицы живого вещества первых клеток. Происходит смешение частиц протопластов двух разных культур, а вместе с ними перемешиваются наследственные признаки, которые затем в потомстве расщепляются с образованием новых вариантов — рекомбинантов.
Возможность поглощения микробными клетками сложных органических соединений — метаболитов микроорганизмов установлена многими исследователями у различных представителей низших существ. Было показано, что такие соединения, как витамины, ауксины, аминокислоты, ферменты, антибиотики и другие жизненно важные вещества, поглощаются клектами микробов через ненарушенную оболочку.
Доказано, что разные метаболиты микробного происхождения могут быть индукторами синтеза специфических биокатализаторов — витаминов, ферментов и прочих соединений. Пенициллин, адсорбированный клетками чувствительных бактерий, индуцирует биосинтез фермента пенициллиназы, сульфамидные препараты — парааминобензойную кислоту (ПАБК) И т. д.
Опарин и Юркевич показали, что пивные дрожжи обладают способностью поглощать из среды энзимы и пользоваться ими. Было также установлено, что поглощенные ферменты побуждают клетки к образованию собственного фермента. Косиков наблюдал образование индуцированного фермента инвертазы у дрожжевых организмов. Клетки, поглотившие инвертазу из питательного субстрата, вскоре начали синтезировать свою собственную инвертазу и пользовались ею при расщеплении сахарозы. Полученные указанным способом варианты сохраняли способность синтезировать этот фермент неопределенно долгое время и передавали такую способность по наследству длительному ряду поколений.
Антибиотические вещества или другие микробные яды, поглощаясь клетками, приводят к образованию у них противоядий, благодаря которым создаются новые, устойчивые варианты. В качестве противоядий или антитоксинов могут служить различные метаболиты, образуемые микроорганизмами. Например, ПАБК синтезируется для нейтрализации яда сульфамидных препаратов; пенициллиназа и стрептомициназа — для противодействия соответствующим антибиотикам и т. д. Резистентность штаммов к сульфамидам определяется степенью образования ПАБК. Чем выше концентрация сульфамида в среде, тем больше требуется и противоядия к нему — ПАБК. Для нейтрализации 50 μг сульфаниламида в среде гемолитический стрептококк вырабатывает парааминобензойной кислоты 0,007 μг; когда доза сульфаниламида увеличивается в три раза, стрептококк усиливает синтез ПАБК тоже в три раза. При увеличении концентрации в среде ПАБК в 10 раз, требуется соответственно больше и сульфаниламида, чтобы оказать антибактериальное действие.
Найдено, что парааминобензойная кислота является специфическим метаболитом, противодействующим сульфамидным препаратам. Она входит в состав витамино-фолиевой кислоты и является жизненно важным веществом микробных клеток.
Многие метаболиты, как известно, имеют существенное значение в жизни клеток микробов, а некоторые из них совершенно необходимы: их функция определяет тот или иной жизненный процесс в клетках. Если по тем или другим причинам блокируется какой-либо из таких метаболитов, клетки становятся иными, биохимические процессы у них протекают не так, как у исходной нормальной клетки. Если данное изменение стабилизируется и передается последующим поколениям, в процессе размножения получаются новые варианты.
Блокирование или изменение свойств метаболитов может происходить под влиянием антиметаболитов или метаболитов, образуемых другими видами микроорганизмов. Взаимодействие метаболитов с антиметаболитами может проявляться в различной форме и в разной степени. Антиметаболит, адсорбируясь клетками из среды, может закрепляться и входить в соединение с метаболитами, нарушая их функции. В результате такой блокировки возможно создание новых вариантов микроорганизмов.
В литературе описаны многие метаболиты, которые имеют соответствующие антиметаболиты, инактивирующие их действие. Витамин B1, или тиамин, имеет аналога-антиметаболита — пиритиамин и неопиритиамин. Пиритиамин парализует действие тиамина. Аналогичные антиметаболиты найдены к биотину, холину, фолиевой кислоте, аскорбиновой, никотиновой кислотам, затем к аминокислотам — триптофану, метионину, глутаминовой кислоте и другим соединениям.
Во всех случаях индуцированной изменчивости — при «наведении» свойств, трансформации, трансдукции и пр. действующее вещество или индуктор перерабатывается живой протоплазмой, участвует в ряде различных биохимических превращений тех или иных метаболитов, вызывая соответствующие изменения их. Процесс передачи свойств от одного организма к другому, по-видимому, возможен только в том случае, когда между ними существует близкое филогенетическое родство. Кроме того, клетки воспринимающей культуры должны обладать соответствующим акцептором, способным связывать индуцирующее вещество наводящей культуры. Утрата этих акцепторов лишает клетку способности изменяться подобным способом.
Явление адаптации к субстрату и внешним агентам может обусловливаться другими причинами, а следовательно, иметь иной механизм. Некоторые исследователи связывают резистентность бактерий к антибиотикам или к фагам с утратой клетками особых веществ «рецепторов», которые захватывают молекулы антибиотика и удерживают их внутри или инактивируют не нарушая целостности клетки.
В ряде случаев механизм образования устойчивости к антибиотикам обусловлен изменением проницаемости оболочек клеток или защитного барьера их. Эрлих в 1909 году показал, что нормальные трипанозомы поглощают акрифлавин, а адаптированные к нему акрифдавин-устойчивые варианты не адсорбируют его. Имеются данные аналогичного порядка и в отношении пенициллина. Некоторые пенициллинустойчивые варианты бактерий поглощают меньше пенициллина, чем чувствительные исходные культуры. Химически очищенный мицетин, по нашим данным, поглощается дифтероидными бактериями Mycobacterium sp. (исходная культура) в количестве 32,5 ед., а резистентный к нему экспериментально полученный вариант — 16,0 ед. на одно и то же число клеток. По наблюдениям отдельных авторов, стрептомицин адсорбируется оболочкой некоторых бактерий и связывается в толще ее нуклеиновыми кислотами. Вследствие этого нарушается обмен веществ и жизнедеятельность клеток протекает отлично от жизнедеятельности нормальных организмов.
Сторонники теории мутаций считают, что в каждой культуре имеются мутации в очень малом количестве, не выявляемом обычными методами микробиологического анализа. По подсчетам разных исследователей на 10в7—10в9 обычных вегетативных клеток, развивающихся на питательных средах при обычных лабораторных условиях, приходится одна мутация. По данным других авторов, число мутаций может достигать 5*10в2, а также и 10в10.
Следует отметить, что авторы определяют число мутаций только по одному признаку. Если же учитывать вариации по различным признакам, а их весьма много, то число мутаций неизмеримо увеличивается. В культуре выявляются варианты, устойчивые к различным агентам — антибиотикам, фагам, химическим реактивам, физическим воздействиям — температуре, лучистой энергии, УФ, рентгеновским лучам и пр. Каждый тип этих воздействий также весьма разнообразен. Антибиотиков, фагов и химических реактивов существует очень много. Каждый из них действует на клетки по-своему и к каждому должны быть заранее подготовлены мутации у микробов. Кроме того, в культуре должны существовать мутации, приспособленные к различным концентрациям и дозам каждого воздействующего агента, которых тоже достаточно много. Для каждого агента количество образуемых мутантов примерно одинаково. Следовательно, если стать на точку зрения теории мутации, то следует допустить, что в каждой культуре предсуществуют мутации, приспособленные ко всем возможным источникам воздействий и к различным дозировкам их. Другими словами, должно быть бесконечное число мутантов; почти каждая клетка культуры в той или иной степени является мутантной, что, конечно, невероятно.
Предполагается, что мутации возникают спонтанно, без всякого воздействия внешних агентов и независимо от среды. Среда только отбирает уже имеющиеся в культуре мутации. При воздействии того или другого агента, оудь то антибиотики, фаги, химикаты или источники физических воздействий, устойчивые к ним клетки — мутанты сохраняются, а все чувствительные формы устраняются.
Мутационная теория не в состоянии объяснить многие явления приспособительной изменчивости. Известно, что микробные клетки могут адаптироваться к антибиотикам (так же, как и к другим агентам), находясь в состоянии покоя, в лаг-фазе развития культуры. При соответствующих условиях в культуре образуется одновременно много адаптированных форм. Процент их можно повысить в значительной степени, до 1—10 и более, тогда как согласно теории мутаций число их обычно не больше 1 на 100—1000 млн. нормальных клеток.
Непонятно также явление ступенчатой адаптации бактерий ко все повышающимся концентрациям антибиотика, а равно и к другим веществам. При высевах на среды с возрастающими дозами действующих агентов частота образования устойчивых вариантов резко возрастает и процесс этот протекает заметно быстрей.
Неясен и факт образования резистентных форм одновременно к двум-трем и более веществам. Еще менее понятно явление устранения приобретенной резистентности у вариантов при воздействии на них других антибиотиков (или других веществ). Мутационная теория также не может объяснить многих других сторон изменчивости.
Выше отмечалось, что между мутациями и адаптациями нет принципиального различия. Так называемые мутанты, возникающие в результате изменения гена, могут становиться адаптивными формами. Наследственное закрепление признаков наблюдается у совершенно очевидных адаптированных вариантов, причем эти признаки передаются через многие тысячи и миллионы генераций. С другой стороны, мутации могут быть нестойкими и сравнительно быстро переходить в исходные формы микробов.
Многочисленные наблюдения и эксперименты последних лет все больше убеждают исследователей в том, что у микроорганизмов изменчивость происходит путем физиологического приспособления к окружающей среде. Живое вещество организмов специфически реагирует на воздействие внешних агентов, меняет свои свойства соответственно качеству действующего вещества. Под влиянием субстрата-индуктора клетки прежде всего реагируют изменением ферментных систем. Многие исследователи считают, что 100 когда вещество индуцирует образование адаптивного фермента, то оно совместно со специфическим компонентом клетки участвует в организации синтеза данного фермента. Адаптивный фермент при длительном воздействии индуктора превращается в конститутивный фермент. Приобретенная способность может передаваться длительному ряду поколений E отсутствие вызвавшего его субстрата.
Благодаря сильно действующим агентам (так называемым мутагенным) происходит расшатывание наследственных свойств организма. Это бывает и в старых культурах микробов. Клетки с расшатанной наследственностью значительно быстрей поддаются воздействию среды. Они легче реагируют на специфические вещества и выявляют те свойства изменчивости, которые были индуцированы отдельными субстратами. Специфика последних накладывает свой отпечаток на формирование новых вариантов, иначе мутантов. Мутанты создаются средой, так же, как и адаптивные варианты. Te и другие представляют собой явление одного порядка.